ابدأ بتوصيل فاصل مغناطيسي بحامله. قم بتوصيل عمود التحديد بالفاصل المغناطيسي وضع مصفاة خلية 70 ميكرون أعلى عمود التحديد. ضع أنبوبا سعة 50 ملليلترا أسفل عمود التحديد لجمع التدفق.
بمجرد أن تصل خلايا دماغ الفأر إلى التقاء 80٪ ، قم بشفط الوسط وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.25٪ تربسين لفصل خلايا الالتصاق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف مخزن مؤقت للتوقف.
أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 غرام لمدة خمس دقائق ، وإزالة طاف. لتلطيخ الأجسام المضادة ، أعد تعليق 10 إلى الخلايا السبع في 100 ميكرولتر من PBS. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة LYVE-1 واخلطه جيدا.
احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي الخلايا وتجاهل الطاف. ثم شطف الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 300 غرام لمدة خمس دقائق.
لوضع العلامات على الميكروبيدات ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من الميكروبيدات. انتفخ واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية. ثم أجهزة الطرد المركزي التعليق وغسل بيليه مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من PBS للاستبعاد السلبي المغناطيسي. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرون للتخلص من الكتل. قم بإعداد عمود التحديد عن طريق شطفه بثلاثة ملليلتر من PBS.
ثم أضف تعليق الخلية إلى عمود التحديد. اغسل العمود بثلاثة ملليلتر من PBS واجمع الخلايا السالبة LYVE-1 في أنبوب سعة 50 ملليلتر. للاختيار الإيجابي المغناطيسي ، ماصة ستة ملليلتر من PBS في عمود التحديد.
ثم اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية عن طريق دفع المكبس بقوة في عمود التحديد للحصول على LYVE-1 LLECs إيجابية. بعد ذلك ، قم بطرد مركزي تعليق الخلية الإيجابية وإزالة المادة الطافية. لوحة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع في قارورة T25 مع خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع.
حافظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يوم بديل. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، افصلها كما هو موضح سابقا قبل إجراء مرور الخلية. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية LYVE-1 في الممر الثاني لم تكن مختلفة بشكل كبير عن المقطع الثالث بعد MACS ، مما يشير إلى نقاء أكبر من 95٪ أكد التلوين المناعي التلوين المشترك ل LYVE-1 مع PDPN و VEGFR-3 و PROX1 ، مما يحدد هوية LLECs.
لم تعبر الخلايا الإيجابية LYVE-1 عن F48 وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية بيتا ، مما يميز بشكل فعال LLECs عن الضامة والخلايا الليفية. أظهرت خلايا Leptomeningeal قبل MACS مورفولوجيا غير متجانسة تتراوح من الكرات المستديرة إلى أشكال الألياف المنصهرة. ومع ذلك ، بعد MACS ، أظهرت LLECs ميزات نموذجية تشبه البطانة مثل أشكال المغزل والحصى.
