لإجراء SPR لتفاعلات VHL-MZ1 ، قم أولا بتنشيط شريحة الستربتافيدين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لجعل أعلى تركيز ، أضف عازلا خاليا من DMSO إلى MZ1 لضمان تركيز DMSO بنسبة 2٪. الآن ماصة 50 ميكرولتر من محلول التركيز الأعلى في بئر يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجاري. تخلط جيدا لإعداد ثاني أعلى تركيز.
بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولترا من المحلول إلى 100 ميكرولتر التالية من المخزن المؤقت للتشغيل ، واخلطه جيدا لإعداد ثالث أعلى تركيز ، وهكذا. استخدم رقائق بلاستيكية شفافة ذاتية اللصق متوافقة مع ألواح البولي بروبلين الدقيقة لتغطية اللوحة. ابدأ SPR باستخدام الإعداد متعدد الدورات.
اضبط الوضع على الأداء العالي ، ووقت الاتصال عند 120 ثانية ، ووقت التفكك عند 300 ثانية ، ومعدل التدفق عند 50 ميكرولترا في الدقيقة. استخدم برنامج التقييم الذي توفره الشركة المصنعة للأداة لتنفيذ تحليل البيانات. لأداء SPR للمجمع الثلاثي VHL-MZ1-BRD4 ، قم أولا بتنشيط الستربتافيدين.
حقن محلول VHL لشل حركته إلى ما يقرب من 100 وحدة رنين. للتحكم السلبي باستخدام BRD4 فقط ، قم بإعداد أعلى تركيز يبلغ 25 ميكرومولار في المخزن المؤقت الجاري بحجم 200 ميكرولتر. إلى الآبار الأربعة التالية ، أضف 160 ميكرولترا لكل منها من 2 ميكرومولار BRD4.
نقل 40 ميكرولتر من البئر A5 إلى A4. ثم ماصة البئر لخلط جيدا. وبالمثل ، قم بنقل 40 ميكرولتر من البئر A4 إلى A3 ، واستمر في هذه العملية حتى الوصول إلى A1. لتشكيل معقد ثلاثي مع MZ1 و BRD4 ، ماصة خارج 196 ميكرولتر من محلول 25.5 ميكرومولار BRD4. لهذا ، أضف أربعة ميكرولتر من 20 ميكرومولار MZ1 المحضر في محلول DMSO بنسبة 100٪.
ماصة 160 ميكرولتر من BRD4 عند اثنين ميكرومول في المخزن المؤقت الجاري إلى الآبار الأربعة التالية على اليسار. بعد ذلك ، قم بنقل 40 ميكرولترا من البئر B5 إلى B4 وماصة لخلطها جيدا. استمر في نقل المحلول من كل بئر حتى B1. الآن قم بتشغيل SPR إلى إعداد الدورة الواحدة بوقت اتصال يبلغ 100 ثانية ، ووقت تفكك يبلغ 720 ثانية ، ومعدل تدفق يبلغ 50 ميكرولترا في الدقيقة.
تم إجراء توصيف المركب الثنائي VHL-MZ1 والمركب الثلاثي VHL-MZ1-BRD4. ولوحظ تعاون إيجابي. تم إجراء توصيف نظام المخ و PROTAC و PPM1D بواسطة SPR.
تستخدم تجارب PPM1D شريحة NTA من النيكل ، ويتم تجديد سطح الرقاقة بعد كل حقن مركب. يظهر BRD-2512 ، الذي يرتبط فقط بالمخ ، و BRD-4761 ، الذي يرتبط فقط ب PPM1D ، استجابة ملزمة ضئيلة. يحفز BRD-5110 تكوين مركب ثلاثي بين PPM1D ويظهر تأثير خطاف بتركيزات مركبة عالية.
