Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of β-Cell Mitophagy

ابدأ بزراعة عينات العيينة المعزولة من النظام الغذائي العادي للدهون أو فئران النظام الغذائي عالية الدهون طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تصميم الظروف التجريبية المطلوبة للدراسة. لكل حالة تجريبية ، باستخدام ماصة ، اختر 100 ثقب في طبق بتري ستة سنتيمترات يحتوي على ملليلتر من وسط العيينة.

للحث على Mitophagy ، عالج الثقوب في أطباق بتري المناسبة مع ميكرولتر من 250 نانو مولار مخزون فالينوميسين لمدة ثلاث ساعات. عزل الثقوب وباستخدام ماصة ، ونقل الثقوب من كل طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي صغير منفصل. بعد ذلك ، قم بتدوير الثقوب عند 350 جم لمدة دقيقة واحدة عند 10 درجات مئوية وباستخدام ماصة ، تخلص من المادة الطافية.

اغسل العينة التي تم الحصول عليها مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بين الغسلات ، قم بتدوير العينة وتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا. لفصل الثقوب إلى خلايا مفردة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، إلى أنبوب عينة واحد.

ماصة محتويات الأنبوب لأعلى ولأسفل بشكل متكرر حتى يتم تشتيت الثقوب بشكل واضح. أضف على الفور ملليلتر واحد من وسط العيينة المسخن مسبقا لتحييد التربسين. أدر العينات عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند 10 درجات سلزية.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. ثم اغسل العينات مرتين بوسط تدفق العيينة. عينات الخلايا جاهزة الآن للتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي لميتوفاجي خلية بيتا.