Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic β-Cells Using MtPhagy Dye

المضي قدما في إجراء تحليل التدفق الخلوي لميتوفاجي خلية بيتا ، مع تعليق خلية واحدة من حوالي 100 جزيرة انعكاس معزولة محضرة ، تتوافق مع كل حالة تجريبية مرغوبة ليتم دراستها. أولا ، أعد تعليق عينات الجزيرة لكل حالة في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة. أضف 0.25 ميكرولتر من مخزون MtPhagy إلى الأنابيب المخصصة لاستقبال صبغة MtPhagi.

وبالمثل ، أضف 0.25 ميكرولتر من مخزون TMRE ومخزون fluozin-3-AM إلى الأنابيب المخصصة المعنية. لف الأنابيب بورق الألمنيوم ودوامة كل أنبوب بسرعة منخفضة لمدة خمس ثوان لخلط المحتويات. ثم احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

في منتصف الطريق من خلال الحضانة ، دوامة كل عينة بسرعة منخفضة لمدة خمس إلى 10 ثوان. بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 350 غرام لمدة دقيقة واحدة عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.

وإعادة تعليق العينات في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة. أضف DAPI إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عينات تتطلب معالجة DAPI. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل المادة الطافية كما هو موضح سابقا.

أعد تعليق البقايا في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة. أخيرا ، ضع العينات على الجليد ثم تابع قياس التدفق الخلوي. اضبط الفولتية للتشتت الأمامي أو FSC والتشتت الجانبي أو SSC لضمان وجود مجموعات الخلايا في مركز مخطط التشتت.

لاستبعاد المضاعفات ، عند بوابة مستطيلة على ارتفاع FSC مقابل عرض FSC ، متبوعا بارتفاع SSC مقابل عرض SSC. اضبط الفولتية والتعويض ل DAPI للتصفية لخلايا بيتا الحية. قم بتعيين بوابات مضان لكل فلوروفور مستخدم بناء على عينة RFD غير الملوثة.

بمجرد إنشاء البوابات ، اجمع 10،000 حدث لكل عينة. تم تعريف خلايا بيتا ذات الاستخدام العالي للميتافاغي على أنها ارتفاع الفلوزين MtPhagy عالية TMRE منخفضة السكان في الربع الثالث أو Q3. تم وصف مستويات الميتوفاجي القاعدية والميتومايسين في كل من جزر RFD و HFD.