Purification of Human Solute Carriers (SLCs) for Developing SLC Targeting Therapies

ابدأ بإذابة حاملات المذاب المجمدة أو كريات خلايا SLC في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. تحضير العازلة للذوبان من خلال الجمع بين 135 ملليلتر من المخزن المؤقت الأساسي وثلاثة أقراص كوكتيل مثبطة للإنزيم البروتيني. بمجرد إذابة الأقراص ، أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للذوبان.

ثم أضف deaminase وانقل التعليق إلى خالط مبرد بالجليد. تجانس المحلول عن طريق تحريك المكبس لأعلى ولأسفل حوالي 20 مرة ، مع إبقاء الخالط على الجليد. بعد ذلك ، أضف محلول مخزون المنظفات إلى 1٪ التركيز النهائي.

انقل خليط الذوبان إلى أنبوب مخروطي حجمه 50 ملليلترا وقم بتدويره ببطء عند أربع درجات سلزية. بعد ساعة واحدة ، الطرد المركزي الخليط ، وجمع طاف. قم بموازنة حجم سرير من أربعة إلى ستة ملليلتر من راتنج Strep-Tactin مع المخزن المؤقت الأساسي.

ثم أضف راتنجا متوازنا إلى المادة الطافية القابلة للذوبان ، وقم بتدويرها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. صب المحلول على عمود تدفق الجاذبية واترك المحلول يتدفق من خلاله. اغسل الراتنج ب 30 ضعف حجم سرير Strep Wash Buffer في ثلاث خطوات متساوية.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للوهم واحتضانه لمدة 15 دقيقة قبل جمع elute. قياس تركيز البروتين بواسطة التحليل الطيفي الماص للأشعة فوق البنفسجية. الجمع بين كسور الوهم المطلوبة ، وإضافة البروتياز 3C.

قم بتدوير الأنبوب ببطء طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بموازنة 2 إلى 4 ملليلتر من حجم السرير من راتنج تقارب معدن الكوبالت مع المخزن المؤقت SEC. أضف راتنج تقارب معدن الكوبالت المتوازن إلى خليط تفاعل 3C طوال الليل ، وقم بتدويره عند أربع درجات مئوية.

بعد ساعة واحدة ، صب المحلول في عمود تدفق الجاذبية وجمع التدفق من خلاله. ركز التدفق في مرشح طرد مركزي مقطوع 100 كيلو دالتون عن طريق الدوران عند 3000 جرام عند أربع درجات مئوية. متوازن ديكستران أرغوس يستند العمود SEC مع المخزن المؤقت SEC.

قم بحقن العينة في حلقة العينة وقم بتشغيل برنامج SEC بمعدل تدفق ، بحيث يكون ضغط العمود أقل من مواصفات الشركة المصنعة للعمود. باستخدام جامع الكسور ، اجمع 300 ميكرولتر من الكسور على مدار فترة SEC بأكملها. بعد تجميع كسور الذروة ، قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

ثم ركز العينات على الحجم المطلوب في مرشح قطع 100 كيلو دالتون. تم تحليل التعبير الأولي لبروتين SLC على نطاق صغير بواسطة الرحلان الكهربائي لصفحة SDS. أكد الفحص المجهري الفلوري ل GFP الموسوم SLC ، توطين البروتين ، الخاص بغشاء البلازما مع تراكم كبير داخل الخلايا.

أنتج البروتين المتجانس كيميائيا وهيكليا ذروة A280 أحادية التشتت واحدة أثناء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.