للبدء ، املأ كوبا من Dounce بملليلتر من محلول تحلل النوى الجليدي البارد الذي يحتوي على 0.01٪ ديجيتونين ، وأضف قطع أنسجة دماغ الفأر المشرحة إليه. باستخدام خالط الأنسجة Dounce الزجاجي ، قم بتجانس الأنسجة 25 مرة لكل منها باستخدام المدقات A و B ، وانقل التجانس الناتج إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر. أضف ملليلتر من محلول تحلل النوى الجليدي البارد الذي يحتوي على 0.01٪ ديجيتونين إلى التجانس واحتضانه على الجليد لمدة خمس دقائق.
ثم ، أجهزة الطرد المركزي النوى عند 500 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة صغيرة ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف أربعة ملليلتر من محلول تحلل النوى الجليدي البارد الذي يحتوي على 0.01٪ ديجيتونين. قم بتصفية تعليق النوى من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
أجهزة الطرد المركزي النواة مرة أخرى ، وإزالة طاف وإضافة أربعة ملليلتر من العازلة تلطيخ لغسل النوى. بعد تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، قم بإذابة النوى عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق النوى في ملليلتر واحد من PBS يحتوي على 0.04٪ مثبطات BSA و RNase. لحساب عدد الخلايا ، امزج 10 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق مع 10 ميكرولتر من النوى في أنبوب 0.5 ملليلتر.
عد النوى باستخدام عداد خلية آلي. نقل 100 ميكرولتر من النوى إلى أنبوب FACS للتحكم غير الملوث. أضف 10 ميكرولتر من 7-AAD إلى النوى المتبقية واحتضانها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، واستمر في فرز النوى باستخدام FACS.
بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولتر من النوى التي تم فرزها إلى أنبوب FACS جديد يحتوي على 90 ميكرولترا من DPBS مع 2٪ FBS معطل بالحرارة. بعد الطرد المركزي للنوى التي تم فرزها ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة وأعد تعليق النوى في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى المخففة. قبل الفرز ، تحتوي العينة على حطام كبير مع أكثر من 99٪ من المفردات الإيجابية للبقع النووية ، مما يشير إلى تحلل الخلايا الفعال.
أظهرت نوى الدماغ بعد الفرز زيادة في النقاء من 36٪ الأولية إلى ما يقرب من 100٪
