للبدء ، خذ قارورة تحتوي على الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية لنخاع عظم الفأر. باستخدام ماصة صغيرة ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل ACK واحتضانها لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. انقل الخليط المعاد تعليقه إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر من خلال مصفاة الخلايا المبللة مسبقا 70 ميكرومتر.
ثم أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS لتخفيف المخزن المؤقت لتحلل ACK. قم بطرد الخليط عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS عن طريق تعليقها أولا في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ثم تغطيتها بتسعة ملليلتر من المخزن المؤقت. الآن ، امزج 10 ميكرولترات من 0.4٪ تريبان أزرق مع 10 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب 0.5 ملليلتر ، وعد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي.
لتلطيخ الخلايا ، قم بطرد الخلايا عند 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت FACS لتحقيق تركيز نهائي قدره واحد في 10 إلى سبع خلايا لكل ملليلتر عن طريق إعادة تعليق الحبيبات أولا في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ثم تغطيتها بالحجم المتبقي. باستخدام ماصة صغيرة P1000 ، انقل التعليق إلى أنبوب FACS من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر.
بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج تلطيخ كما هو موضح هنا. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق تعليق الخلية في 300 ميكرولتر من التلوين ، امزج واحدا في أنبوب عينة واحتضانه على الجليد لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. ثم أضف 300 ميكرولتر من المزيج اثنين في أنبوب العينة واحتضانها لمدة 20 دقيقة على ثلج محمي من الضوء.
أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS إلى أنابيب العينات الملطخة والمختلطة المفردة. الآن أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 ملليلتر مملوء مسبقا ب 500 ميكرولتر من وسط التجميع. وبمجرد معايرة أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية إلى معلق الخلية، ثم انقل ملليلترا واحدا من العينة من خلال غطاء مصفاة خلوي 35 ميكرومتر إلى أنبوب جديد لنظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد فرز الخلايا ، انقل 10 ميكرولترات من الخلايا التي تم فرزها إلى أنبوب FACS جديد يحتوي على 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت FACS.
بيليه تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر من PBS مع 0.04٪ BSA. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 0.2 ملليلتر وأضف 50 ميكرولترا من PBS مع BSA إلى الأنبوب الأصلي لجمع أي خلايا متبقية. انقل الخلايا إلى الأنبوب سعة 0.2 ملليلتر للوصول إلى الحجم الكلي البالغ 100 ميكرولتر.
قم بإجراء تجربة تجريبية لتحديد أفضل وقت تحلل لعزل النوى. بعد تكوير النواة, أعد تعليق حبيبات النوى في 12 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى المخففة. أضف ميكرولتر من النوى إلى أنبوب يحتوي على 0.4٪ تريبان أزرق وثمانية ميكرولتر من PBS مع 0.04٪ BSA وعد النوى باستخدام عداد خلية آلي.
بعد الانتهاء من عزل النوى، انقل ستة ميكرولترات من إعادة تعليق النوى إلى أنبوب FACS جديد مملوء مسبقا ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أضف ثلاثة ميكرولتر من 7-AAD واحتضانها لمدة خمس دقائق على الجليد.
