للبدء ، قم بتسمية أنبوبي فاكس جديدين كأنبوبين مختلطين واحد واثنين. قم بإعداد معلق الخلية والأجسام المضادة وفقا للجدول المعطى لتحليل التدفق الخلوي. بعد احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة ، اغسل كل أنبوب مرتين بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب الدوامة عند 200 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. قم بتغطية آبار 48 صفيحة بئر ب 200 إلى 500 ميكرولتر من FBS ، واحتفظ بها لمدة ساعة واحدة.
ثم ماصة 200 إلى 500 ميكرولتر من وسائط MSC 10٪ بعد إزالة FBS المتبقية. لتحضير العينات لفرز الخلية الواحدة ، ماصة ملليلتر واحد من FBS في أنبوبي فاكس جديدين. لف الأنابيب لإنشاء طبقة متساوية من FBS على السطح الداخلي للأنبوب.
قم بإعداد تعليق الخلية والجسم المضاد في أنبوبين مختلطين واحد واثنين ، وفقا للجدول ، لتجربة الفرز. ثم احتضان الأنابيب في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل باستخدام عازل تلطيخ ، قم بطرد الأنابيب عند 200 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ واحتضانها لمدة 15 دقيقة في خمسة ميكرولتر من DAPI قبل الفرز. لإعداد مصفوفة التعويض ، استخدم أنابيب تعويض البقع المفردة. انقر فوق التجربة من شريط الأدوات في برنامج الجهاز.
ثم انقر فوق إعداد التعويض ، متبوعا بإنشاء عناصر تحكم في التعويض. بعد ذلك ، انقر فوق أنبوب غير ملوث ، متبوعا بالمعلمات في مربع حوار مقياس الخلايا. اضبط الفولتية عن طريق تحرير القيم لكل معلمة.
انقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ ثم انقر فوق اكتساب. اسحب بوابة P-1 إلى محتوى الخلية وقم بتطبيقها عبر جميع عناصر التحكم في التعويض لتعيين الجهد والبوابة السالبة لكل معلمة. الآن قم بتحميل أنابيب تعويض البقع الفردية بشكل فردي.
تسجيل البيانات وحفظها. حدد التجربة الحالية ، وانقر بزر الماوس الأيمن عليها ، وحدد حساب قيم التعويض ، متبوعا بالرابط والحفظ. قم بتشغيل الأنبوب المختلط واحد وسجل 10،000 خلية.
قم بتعيين البوابات على السكان المهتمين ليتم فرزها باستخدام استراتيجية البوابة المناسبة. بعد ذلك ، قم بتحميل لوحة تجميع في الجهاز وقم بتعيين رقم خلية مستهدف ، يتراوح من 2،500 إلى 5،000 خلية لكل بئر. ثم حدد قناع نقاء فرز الخلية الواحدة.
اجمع مجموعات الخلايا التي تم فرزها في جهاز تجميع ، مع الاحتفاظ بها على الجليد طوال مدة تجربة الفرز. أخيرا ، قم بتحويل الألواح إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ للحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية. لم تظهر مخططات مقايسات قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات أي تعبير عن النمط المتماثل FITC للأجسام المضادة CD 90 FITC.
التعبير الإيجابي للعلامات CD-90 و CD-73 والتعبير السلبي ل CD-45 يمكن مقارنته بضوابط FMO غير الملوثة. أظهرت الأنماط الظاهرية المناعية توزيع العلامات من أحد المقاطع المبكرة باستخدام العلامات الموصى بها من ISCT و CD-44 ، مما يحدد السكان الأصليين على أنهم MSCs. تم استخدام حظائر المرور المتأخر لفرز الخلية المفردة للتعبيرات العالية والخافتة.
أظهرت الخلايا التي تم فرزها بعد جمعها في صفيحة البئر 48 الالتصاق والانتشار ، مثل السكان الأصليين. الخلايا التي تم فرزها بعد متباينة في وجود عوامل نمو دهنية.
