قم بعزل الخلايا المتخصصة في الأطراف ، أو LNCs ، أثناء العمل في ظل ظروف معقمة على طاولة عمل فائقة النظافة. استرجع نسيج الحافة من المصطلح الوسيط لتخزين القرنية. باستخدام شفرة جراحية مستديرة معقمة ، اكشط وإزالة القزحية والبطانة حول القرنية.
بعد ذلك ، باستخدام الشفرة المستديرة الجراحية المعقمة ، قم بتقطيع أنسجة الأطراف إلى 12 قطعة متساوية ، تاركا ملليمترا واحدا فقط من الأنسجة على جانبي القرنية والصلبة. بعد ذلك ، انقل 12 قطعة من الأنسجة الطرفية إلى صفيحة استزراع 35 ملم ، وأضف 1 ملليلتر من كولاجيناز أ لغمر الأنسجة تماما في اللوحة. هضم الأنسجة عن طريق احتضان لوحة الثقافة في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
قم بإذابة مصفوفة الغشاء أو الغشاء القاعدي في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية. قم بإعداد كيس معقم يحتوي على 200 ميكرولتر و 1 ملليلتر ، وأنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر ، ولوحة بئر 6 ، وضع الكيس في درجة حرارة 20 أو 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة. بعد استرداد النصائح وأنبوب الطرد المركزي و 6 ألواح جيدة من المبرد ، تابع تنفيذ الخطوات التالية على طاولة عمل فائقة النظافة.
باستخدام طرف 200 ميكرولتر مبرد مسبقا ، ماصة 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاع المذاب في 1 ملليلتر من MESCM ، واخلطها برفق. باستخدام طرف مبرد مسبقا سعة 1 ملليلتر مثبت على ماصة ، انقل مصفوفة الغشاء القاعدي الناتجة بنسبة 5٪ إلى بئر واحد من لوحة استزراع الآبار 6 المبردة مسبقا. رج الطبق 6 برفق أفقيا قبل وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبا لتحضير صفيحة الاستزراع المطلية ب 5٪ ماتريجيل.
بعد عملية الهضم لمدة 18 ساعة ، استرجع الكولاجين A من الأنسجة الطرفية المهضومة ، والتي تحتوي في الغالب على مجموعات صغيرة مرئية. العمل تحت مجهر ستيريو ، استخدم طرف ماصة 200 ميكرولتر لفصل المجموعات عن الأنسجة الصلبة غير المهضومة. اغمر المجموعات المنفصلة في 0.25٪ Trypsin-EDTA في لوحة استزراع 35 ملم ، واحتضن اللوحة لمدة 15 دقيقة.
ثم أضيفي 1 ملليلتر من MESCM مع مصل بالضربة القاضية بنسبة 10٪ إلى الطبق لإرواء هضم الخلايا. ماصة التعليق برفق لأعلى ولأسفل مع طرف ماصة 1 ملليلتر لتقسيم المجموعات إلى خلايا فردية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 200 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
دون إزعاج حبيبات الخلية ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأضف 1 ملليلتر من MESCM لإعادة تعليق الخلايا. باستخدام طرف ماصة سعة 1 ملليلتر ، قم بسحب المحتوى لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات لضمان إعادة تعليق الحبيبات بالكامل في MESCM. جمع 20 ميكرولتر من التعليق لعد الخلايا.
بعد ذلك ، باستخدام ماصة 1 ملليلتر ، قم بنقل تعليق الخلية إلى مصفوفة الغشاء القاعدي 5٪ المطلية ب 6 صفيحة جيدة. أضف MESCM لجعل الحجم الكلي في البئر 2.5 ملليلتر. هز بلطف 6 لوحة جيدا أفقيا لضمان توزيع موحد للخلايا.
بعد تصوير الخلايا ، انقلها إلى حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. نجح البروتوكول الموضح في هضم أنسجة حافة القرنية الصلبة ، مما أدى إلى توليد مجموعات يمكن تصورها تحت المجهر. كما هو متوقع ، تشبه المجموعات شكل اليرقة.
نمت LNCs الأولية ببطء وتطلبت حوالي 12 يوما للثقافة. احتاجت LNCs من الممر 1 إلى الممر 8 إلى حوالي ثلاثة أيام للمرور ، لكن معدل نمو LNCs بعد الممر 9 انخفض بشكل ملحوظ. من الناحية الشكلية ، كانت LNCs على شكل مغزل ومستديرة في الممر 0.
بعد المقطع 3 ، كانت على شكل مغزل بأحجام موحدة. يمثل عدد مضاعفة الخلايا أو NCD معدل نمو LNCs. كشفت منحنيات الأمراض غير المعدية والأمراض غير المعدية التراكمية أن LNCs نمت بشكل أسرع من الممر 3 إلى الممر 5.
