لتحديد الخلايا المتخصصة في الأطراف أو LNCs عن طريق تلطيخ التألق المناعي ، أضف 1 ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA لكل بئر إلى LNCs المستزرعة في 5٪ Matrigel المغلفة 6 لوحة بئر. هضم الخلايا عن طريق احتضان اللوحة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. إخماد الهضم عن طريق إضافة 1 ملليلتر من مصل خروج المغلوب الذي يحتوي على MESCM إلى تعليق الخلية.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي عليه 200G لمدة خمس دقائق قبل استنشاق بعناية طاف طق. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من MESCM. بعد ذلك ، باستخدام cytofuge ، قم بإيداع 80 ميكرولترا من تعليق الخلية بالتساوي على أربع شرائح مجهرية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق تقريبا. ثم تخلل الخلايا الموجودة على الشرائح باستخدام 0.2٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة. قم بسد الخلايا التي تحتوي على 2٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة ساعة واحدة قبل حضنها بالأجسام المضادة الأولية على شاكر طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة عن طريق غسل الشرائح باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك ، احتضان العينة بأجسام مضادة ثانوية مناسبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل غسل أي أجسام مضادة غير مرتبطة كما هو موضح سابقا. قم بتلطيخ النوى بتركيز DAPI بمقدار 5 ميكروجرام لكل ملليلتر.
بعد إغلاق الشرائح ، قم بإجراء التصوير باستخدام مجهر مضان. باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من LNCs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم باستخدام مجموعة نسخ DNA أو CDNA تكميلية عالية السعة ، قم بنسخ عكسي من 1 إلى 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
قم بإعداد محلول 20 ميكرولتر يحتوي على 2.5 ميكرولتر من CDNA ، و 0.8 ميكرولتر من التمهيدي الجيني المقابل ، و 10 ميكرولتر من مزيج رئيسي عالمي PCR ، و 6.7 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. ثم قم بإجراء تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل باستخدام الظروف المناسبة. أخيرا ، استخدم تقنية التصوير المقطعي المحوسب المقارن لفحص التعبير الجيني النسبي.
كشف التلوين المناعي المزدوج للممر الرابع LNCs بوضوح أن هذه الخلايا كانت باستمرار سلبية panCK ، وإيجابية VIM ، وإيجابية CD90 ، وإيجابية CD105 ، وإيجابية SCF ، وإيجابية PDGFR.
