Protein Detection in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells Using Western Blotting

للبدء ، قم بنقل خلايا الورم الغدي في المعدة باستخدام TMEM200A Si-RNA واحتضانها لمدة يومين. بعد ذلك ، تخلص من وسط زراعة الخلايا من الآبار واغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ضع الخلايا على الثلج وأضف 150 ميكرولترا من محلول تحلل تحلل مقايسة المناعة الإشعاعية المبردة مسبقا.

باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية ، افصل الخلايا الملتصقة بعناية عن الطبق وانقل محلول الخلية برفق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا. بعد ذلك ، يتم تحليل الخلية عند 1.5 × 10 إلى الطاقة أربعة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA ، حدد محتوى البروتين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

قم بتحميل 30 جراما من البروتين من كل عينة على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪. قم بتشغيل الجل عند 80 فولت لمدة 0.5 ساعة ، تليها 1.5 ساعة عند 120 فولت. بعد ذلك ، قم بنقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF 45 ميكرومتر بتيار ثابت يبلغ 300 مللي أمبير لمدة 1 إلى 1.5 ساعة.

ضع غشاء PVDF على شاكر لمدة ثلاث دورات مدة كل منها خمس دقائق. بعد الرج ، أضف TBST إلى الحاوية بحيث يكون جانب البروتين متجها لأعلى. ضع الغشاء في المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الغشاء باستخدام TBST لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 10 دقائق. احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST ، أضف جسما مضادا ثانويا للأرنب أو الفأر واحتضانه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف ركيزة ECL إلى غشاء PVDF لمدة 30 ثانية واكتشف الإشارة باستخدام نظام التصوير. انخفضت كفاءة TMEM200A بشكل كبير في خلية سرطان المعدة HGC-27 المنقولة مع Si-RNA ، مقارنة بالخلايا غير المنقولة. يثبط TMEM200A Si-RNA بشكل كبير البروتينات ذات الصلة في انتقال اللحمة المتوسطة الظهارية ، ويؤثر على فسفرة AKT في مسار إشارات phosphoinositide 3-kinase.