للبدء ، قم بإعداد عينات من البروتينات والفوسفوبروتيوم للحويصلات خارج الخلية المعزولة من عينات البول باستخدام نهج EVtrap. حقن العينات في مطياف كتلة وقت الرحلة المحاصر من خلال نظام الكروماتوغرافيا السائلة. افصل الببتيدات إلى عمود C18 طوله 15 سم.
لتحليل البروتيوميات ، احصل على البيانات باستخدام طريقة dia-PASEF مع نطاق كتلة لكل منحدر يمتد من 300 إلى 1200 نسبة كتلة إلى شحنة وثابت حركة أيونية من 0.6 إلى 1.50 1 / عقدة. لتحليل الفوسفوبروتيوميكس، الحصول على البيانات باستخدام طريقة اكتساب dia-PASEF. اضبط نطاق الكتلة لكل منحدر ليمتد من 400 إلى 1550 نسبة الكتلة إلى الشحنة في ثابت الحركة الأيونية من 0.6 إلى 1.50 1 / عقدة.
قم بتحميل الملفات الأولية في برنامج البروتين. قم بإعداد معلمات البحث في قاعدة بيانات الإنسان العاقل. لنوع الهضم، حدد محدد، وضمن الإنزيمات، حدد التربسين.
حدد طول الببتيد بحد أدنى 7 و 52 كحد أقصى واترك انقسامين مفقودين. ثم اضبط الحد الأقصى للتعديلات المتغيرة على 5. يجب أن يكون التعديل الثابت هو كارباميدوميثيل في السيستين ، بينما يجب أن تشمل التعديلات المتغيرة بروتين الأسيتيل N-Terminal ، والأكسدة في الميثيونين ، والفسفرة في سيرين ، ثريونين ، وتيروزين.
أخيرا ، اضبط معدل الاكتشاف الخاطئ لمطابقة طيف الببتيد والببتيد ومجموعة البروتين على 0.01. في التنميط البروتيني LCMS و MS ، كشف 2٪ من كل عينة عن أكثر من 11،000 ببتيد فريد من حوالي 2،200 بروتين. والجدير بالذكر أنه تم العثور على 72٪ من البروتينات الفريدة باستمرار في جميع النسخ المتماثلة الثلاثة وتم تحديد 90 من أفضل علامات EV والبروتينات مقارنة بقاعدة بيانات ExoCarta.
تم تأكيد الدقة الكمية بمعامل تباين منخفض متوسط بنسبة 5.7٪ مما يدل على قابلية عالية للتكرار والموثوقية. بالنسبة لعلم الفوسفوبروتيوميكس ، أنتجت 98٪ من كل عينة ببتيد 800 ببتيد فوسفوببتيد فريد و 350 بروتين فوسفوبروتين. نتج عن التخصيب 72٪ فوسفوسيرين و 22٪ فوسفوثريونين و 6٪ ببتيدات فوسفوتيروزين.
تم تحديد 42٪ من الفوسفوببتيدات في جميع النسخ المتماثلة في معامل متوسط للاختلاف قدره 21.8٪ ، مما يشير إلى قابلية التكاثر الكمي المقبولة.
