Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

لبدء استخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة وسائط النمو من قارورة T75 التي تحتوي على 70٪ من ثقافة MDA-MB-231 المتقاربة. أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لفصل الخلايا عن القارورة. ثم لتحييد التربسين ، أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM في القارورة.

جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي وتدور في 400 غرام لمدة أربع دقائق. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام عداد الخلية ، حدد تركيز الخلية.

انقل ثماني مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وأضف PBS لجعل الحجم إلى ملليلتر واحد. ثم أضف ميكرولتر من CFSE في الأنبوب وامزج تعليق الخلية جيدا باستخدام ماصة واحدة ملليلتر. ضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لتكسير الخلايا التي تحمل علامة CFSE. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من DMEM. بعد إعادة تقييم تركيز الخلية ، انقل أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى خزان كاشف سعة 25 ملليلتر.

أضف DMEM لجعل الحجم ثمانية ملليلتر وامزج تعليق الخلية مع ماصة مصلية خمسة ملليلترات. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل صف في النصف الأيسر من لوحة سوداء ذات 96 بئرا. وبالمثل ، أضف تعليق خلية خروج المغلوب EGFR على النصف الأيمن من اللوحة.

لضمان توزيع موحد للخلايا ، حرك اللوحة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر على المنصة. احتضان اللوحة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للخلايا السرطانية لتعلق. بناء على عدد خلايا Jurkat غير المنقولة والمعبرة عن CAR ، انقل أربعة في 10 إلى خلايا CAR-J الخامسة إلى خزان سعة 25 ملليلتر.

أضف DMEM إلى الخزان إلى الحجم النهائي 2 ملليلتر. للحصول على نسبة مستجيب إلى ورم تبلغ 4: 1 ، أضف مرتين في 10 إلى خلايا CAR-J الرابعة لكل بئر في 100 ميكرولتر من الوسط على طول جانب البئر دون إزعاج الخلايا السرطانية المرفقة. ثم أضف 100 ميكرولتر من DMEM إلى جانب الآبار التي تحتوي على خلايا الورم و Jurkat للحصول على 300 ميكرولتر من الحجم لكل بئر.

حرك اللوحة كما هو موضح لضمان توزيع موحد لخلايا Jurkat على الخلايا السرطانية. اسمح للثقافة المشتركة بالاستقرار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.