Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

بعد الزراعة المشتركة ل CAR للتعبير عن jurkats مع الخلايا السرطانية التي تحمل علامة CFSE ، اقلب اللوحة برفق على منشفة ورقية وانقر للتخلص من المواد الطافية التي تحتوي على CAR-J. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط FluoroBrite DMEM التي تحتوي على هرمون البروبيديوم اليود ، أو PI ، في الآبار دون إزعاج الخلايا السرطانية الملتصقة. ثم أضف 20 ميكرولترا من 20٪ Triton X إلى البئر الأول من كل نوع من أنواع الأورام ، لتكون بمثابة تحكم كامل في الموتى.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة قبل التصوير. بعد التصوير بالفلورسنت ، استخدم أحد آبار الخلايا للورم فقط لمعايرة قناة الفلورسنت الخضراء. لاستبعاد الخلايا الموجودة على حافة الآبار ، قم بتقليل قناع البئر إلى 98٪ حدد الخلايا السرطانية التي تحمل علامة CFSE على قناة الفلورسنت الخضراء واضبط قيمة عتبة شدة التألق لالتقاط جميع الخلايا في البئر.

اضبط الحد الأدنى لقطر الخلية على 25 ميكرومتر لاستبعاد الحطام المكتشف في قناة CFSE. ثم قم بتمكين كائنات لمس منفصلة لتحديد الخلايا الفردية. بعد ذلك ، حدد البوابات لتحديد مجموعات الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة.

حدد الخلايا المسماة CFSE وقم بإنشاء مدرج تكراري للأعداد على المحور y مقابل متوسط كثافة PI على المحور x. اضبط قيمة المحور السيني لتصور الخلايا بشكل أفضل وارسم مقسم للتمييز بين الخلايا الملطخة منخفضة PI والخلايا الملطخة عالية PI. قم بتسمية الخلايا الملطخة منخفضة PI كخلايا حية.

بعد ذلك ، قم بتعيين مدرج تكراري آخر على الخلايا الحية ذات المساحة على المحور السيني والعد على المحور ص. قم بتسمية الخلايا غير الحطامية على أنها خلايا حية كبيرة. ثم ارسم مقسم آخر باستخدام الورم جيدا فقط لالتقاط الخلايا وتصفية الحطام.

بعد تشغيل التحليل على اللوحة بأكملها ، قم بتصدير جدول البيانات الذي يحتوي على الأرقام. ارسم عدد الخلايا الكبيرة لتحديد عدد الخلايا السرطانية الحية التي تحمل علامة CFSE المتبقية في البئر بعد التعرض ل CAR-J. أخيرا إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA.

زادت السمية الخلوية ل CAR-J1 مع ارتفاع نسبة المستجيب إلى الورم ولوحظ أكثر من 50٪ قتل عند نسبة المستجيب إلى الورم من أربعة إلى واحد. أظهرت تركيبات CAR التي تستهدف EGFR مع مجالات مفصلية معدلة قتلا خاصا بالمستضد ضد EGFR يعبر عن خلايا MDA-MB-231 ، ولم يلاحظ أي قتل كبير ضد خلايا خروج المغلوب EGFR. كما تم التعبير عن تركيبات CAR على الخلايا التائية CD3 المشتقة من PBMC.

ومع ذلك ، لم يكن هناك تعبير عن EGFR-CAR المحتوي على المفصلة CD8. أظهر IgG القصير أقل فعالية سامة للخلايا ضد خلايا MDA-MB-231 مقارنة بوسط IgG الطويل و IgG.