طريقة واحدة وخطوتين لعزل العدلات في الفئران لحصاد مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)

لبدء حصاد نخاع العظم ، انقع فأرا مقترحا في 75٪ إيثانول لتعقيم الفراء والجلد. ضع الجرذ على ظهره واقطع الأطراف السفلية عند الورك لحماية رأس عظم الفخذ. استخدم مقص التشريح لقطع الرباط عند مفصل العرقوب.

ثم قم بطي مفصل الركبة للخلف لكشف عظم الفخذ والساق. باستخدام زوج من الملقط والمقص ، قم بإزالة أي عضلات وأوتار وأنسجة أخرى متصلة بالعظام بعناية. كزة النخاع من خلال طرفي العظام باستخدام حقنة إبرة 5 ملم لتخفيف مصفوفة النخاع.

الآن استخدم حقنة جديدة لطرد نخاع العظم باستخدام 10-15 ملليلتر من وسائط RPMI. الطرد المركزي خلايا نخاع العظم في 300G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5-10 ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء.

بعد احتضان التعليق ، أضف أربعة أضعاف حجم HBSS إلى الخليط. ثم أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم الحبيبات الناتجة لمزيد من الاستخدام.

اعزل العدلات أولا باستخدام مجموعة عزل العدلات في نخاع عظم الفئران. طبقة 2 ملليلتر من 80-55 ٪ لكل كاشف العقيد في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر ، لإنشاء تدرج الكثافة. ثم ماصة العدلات المعزولة ، أو محلول إعادة تعليق الخلايا المعزولة مع مجموعة عزل العدلات نخاع عظم الفئران ، في الأنبوب.

جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 جرام لمدة 40 دقيقة عند 20 درجة مئوية. باستخدام ماصة معقمة ، اجمع طبقة التدرج 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند حدود 65-70٪. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر.

أضف 15 ملليلترا من HBSS في الأنبوب واقلبه برفق لخلط محتوياته. أخيرا ، قم بطرد الأنبوب عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. بالنسبة للعملية المكونة من خطوة واحدة ، بعد سحب تعليق نخاع العظم مباشرة في أنبوب تدرج الكثافة ، أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، قم بإخراج طبقة التدرج 70٪ ، بما في ذلك الطبقات عند حد التدرج 75-70٪. نقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من HBSS. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 400G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا.

عد العدلات المعزولة باستخدام مقياس الدم ، وقم بتقييم صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق. كان للطريقة المكونة من خطوتين مستوى نقاء محسن بنسبة 90٪ مقارنة ب 50٪ التي حققتها طريقة الخطوة الواحدة.