اقتناء مصائد العدلات خارج الخلية للفئران (NETs) والتحقق منها

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

106 Views

•

02:35 min

•

April 26th, 2024

DOI :

10.3791/200811-v

April 26th, 2024

•

Xiangfeng Gong*¹, Yutao Sun*¹, Xiaoxin Zhang²^,³, Zhenghua Xiao¹^,⁴, Li He¹^,⁴, Chaoyi Qin¹^,⁴

¹Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, ²Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, ³West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, ⁴Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Transcript

للبدء ، أعد تعليق العدلات المعزولة للفئران في أربعة ملليلتر من وسائط RPMI المكملة في طبق بتري معقم 10 سم. بعد ذلك ، أضف أربعة ميكرولتر من PMA إلى تعليق العدلات لتحفيز تكوين NETs. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

للتحكم السلبي ، أضف أربعة إلى خمسة ميكرولترات من DNASE1 إلى تعليق العدلات لتحلل الشبكات المفرزة. ثم أضف أربعة ملليلتر من HBSS لغسل NETs. اغسل اللوحة بأربعة ملليلتر من وسائط الاستزراع الطازجة لكل لوحة لفصل الشبكات.

الآن ، اجمع وسيط الغسيل في أنبوب وماصة جديدين بشكل متكرر لضمان إعادة التعليق الكامل للشبكات. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لإزالة أي خلايا عائمة. بعد ذلك ، اجمع الوسيط الطافي باستخدام الشبكات في أنبوب جديد.

أجهزة الطرد المركزي تعليق الشبكات والخلايا العائمة في لوحة 24 بئرا مع زلات غطاء زجاجي 1.4 سم موضوعة فيه لتسوية أي خلايا عائمة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا الموجودة على قسائم الغلاف بنسبة 4٪ PFA وتابع التحقق من وجود NETs. بعد ذلك ، ضع قطرة من HBSS على حامل أنبوب اختبار مغطى بفيلم البارافين.

اقلب انزلاق الغطاء في قطرات HBSS لغسله. بعد الغسيل ، احتضان الخلايا في 250 ميكرولتر من 0.5x Triton X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لاختراقها. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS لمدة دقيقة واحدة.

أغلق الخلايا في مصل حمار عادي بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أخيرا ، احتضان الخلايا ب 70 إلى 90 ميكرولترا من الأجسام المضادة للفئران طوال الليل عند أربع درجات مئوية. اغسل قسيمة الغطاء في HBSS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها.

الآن ، احتضان انزلاق الغطاء في الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام قبل غسل HBSS. تلطيخ نوى الخلية والهياكل العظمية للشبكات في 70 إلى 90 ميكرولتر من DAPI. أداء غسل HBSS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما.

Explore More Videos

Rat Neutrophil

Neutrophil Extracellular Traps NETs