للبدء ، قم بإزالة الحبل الشوكي للفأر مقطوع الرأس الذي تم اختراقه باستخدام برنامج تلفزيوني. اغمر الحبل الشوكي في DPBS البارد في طبق بتري على الجليد. باستخدام إبرة قياس 18 وحقنة سعة 10 ملليلتر مملوءة ب DPBS البارد ، استخدم البثق الهيدروليكي لعزل الحبل الشوكي بالكامل في غطاء التدفق الصفحي.
نقل الحبل الشوكي إلى طبق بتري مع DPBS الباردة وضعت على أكياس الثلج. باستخدام المجهر داخل غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة أي سحايا مرئية بعناية باستخدام ملقط حاد. بعد ذلك ، انقل الحبل الشوكي إلى طبق بتري فارغ واستخدم شفرة مشرط جراحي رقم 10 لتقطيعه إلى قسمين إلى ثلاثة ملليمترات.
للتفكك الأنزيمي للخلايا الشوكية ، أضف Enzyme Mixes 1 و 2 إلى قطع الحبل الشوكي. قم بتدوير الإنزيمات في الطبق عدة مرات لضمان طلاء موحد للحبل الشوكي. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وقم بتدوير الطبق يدويا كل 10 دقائق.
بعد الحضانة ، أضف 350 ميكرولتر من DNAse I.قم بتدوير الطبق برفق لخلطه. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من DMEM البارد المكمل ب 0.5٪ FBS قبل الخلط برفق. نقل المحتويات بالكامل على الفور إلى أنبوب خمسة ملليلتر.
باستخدام ماصة P1000 ، قم بسحن الأنسجة برفق ثلاث مرات. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور الزجاجية مقاس 9 بوصات لسحن الأنسجة برفق خمس مرات أخرى. ضع الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 30 ثانية للسماح للأنسجة بالاستقرار.
باستخدام ماصة P1000 ، قم باستنشاق المادة الطافية ونقلها من خلال مرشح 30 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. إلى الأنبوب مع الأنسجة المتبقية ، أضف ملليلتر واحد من DMEM المكمل ب FBS. ثم سحن بلطف ثلاث مرات باستخدام ماصة باستور.
بعد ترك الأنسجة تستقر في القاع ، مرر المادة الطافية من خلال مرشح 30 ميكرومتر واجمعها في نفس الأنبوب سعة 15 ملليلتر المستخدم سابقا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة عند 300 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم شفاط فراغ للتخلص بعناية من المادة الطافية.
استخدم محلول إزالة الحطام الموجود في مجموعة تفكك الدماغ للبالغين لإزالة المايلين من حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM المكمل ب FBS إلى الحبيبات واقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات للخلط. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من DPBS المكمل ب FBS.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى قبل التخلص من المادة الطافية. تم تسمية الخلايا ب Anti-ACSA-2 MicroBeads وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم أعمدة الفصل المغناطيسي لفصل الخلايا عن طريق الاختيار الإيجابي.
ثم ، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة 10 دقائق قبل التخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من DMEM الدافئ المكمل ب FBS. نقل تعليق الخلية إلى مقياس الدم لعد الخلايا وتقييم صلاحيتها.
اضبط تركيز الخلية على 75،000 خلية لكل 50 ميكرولتر باستخدام FBS DMEM. بعد ذلك ، انقل 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى غطاء مطلي بالبولي l-lysine في لوحة 24 بئرا. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للخلايا بالالتصاق بغطاء الغطاء.
ثم أضف بعناية 450 ميكرولتر من FBS DMEM الدافئ والمكمل بالمضادات الحيوية إلى كل بئر. لوحظ عزل وانتشار ناجح للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية. بحلول اليوم الرابع ، لوحظ أن الخلايا النجمية تشكل عمليات أطول ، بينما شوهدت خلايا دبقية صغيرة بيضاوية ذات مغازل أقصر.
شكلت الخلايا النجمية طبقة متقاربة متصلة بحلول اليوم السابع ، مع عرض الخلايا الدبقية الصغيرة لعمليات أقل وأقصر. أكد فرز الخلايا صلاحية الخلية بنسبة 92 إلى 93٪ لثقافة الخلية المعزولة.
