تفكك الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتحديد مرحلة الحفظ بالتبريد الأمثل

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

56 Views

•

03:06 min

•

November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200823-v

November 3rd, 2023

•

Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Transcript

للبدء ، قم بتخفيف قارورة من مصفوفة غشاء القاع البارد المذاب مع 12 ملليلتر من DM EM F12. خلط التعليق جيدا. أضف غطاء واحد في كل بئر من صفيحة 24 بئرا.

ثم ، ماصة 250 ميكرولتر من محلول المصفوفة المخففة في كل بئر. تخلص من وسط الاستزراع لألواح الخلايا الظهارية الصبغية الصباغية الشبكية المستنبتة hESC. اغسل الأطباق مرتين بمليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا لكل بئر.

بعد ذلك ، أضف 0.5 ملليلتر من كاشف تفكك الخلايا إلى آبار ألواح الاستزراع ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لبدء عملية الهضم. بعد الحضانة ، راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر لتأكيد نهاية الهضم. الآن مع ماصة ملليلتر واحد ، ماصة بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا 10 مرات.

أضف وسط ثقافة مسخن مسبقا لتخفيف التعليق. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 250 G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسكب المادة الطافية من أنبوب الطرد المركزي.

ثم ، أعد تعليق بيليه الخلية في ملليلتر من وسط الثقافة. استخدم ماصة لخلط الخلايا من 10 إلى 15 مرة. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.

بعد ذلك ، عد الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين. نضح محلول الطلاء قبل الطلاء. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط الاستزراع في كل بئر وقم بزرع الخلايا الموجودة على زلات الغطاء.

بعد دمج EDU وتلطيخه ، التقط صورا لخمسة حقول عشوائية باستخدام مجهر مضان. احسب النسبة المئوية للخلايا الموجبة EDU. بعد ذلك ، ارسم منحنيات وقت النسبة المقابلة لإنشاء منحنى نمو.

أخيرا ، حدد نافذة التجميد من المرحلة الأسية لكل خط خلية. فقدت الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين في البداية مورفولوجيتها السداسية المميزة ، لكنها استعادتها لاحقا في المرحلة الأسية من النمو. عندما تم استزراع الخلايا لمدة أسبوع إضافي ، انخفض تكاثر الخلايا.

أكد اختبار انتشار EDU أن خلايا اليوم الخامس P2 أظهرت معدل انتشار أعلى ، في حين أن خلايا اليوم 11 P2 قد دخلت مرحلة التباطؤ.

Explore More Videos

Human Embryonic Stem Cells

Retinal Pigment Epithelial Cells

Microscopy Observation

Cell Suspension

Centrifugation