للبدء ، قم بفصل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من hESC ، وقم بإعداد تعليق الخلية ، ثم عد الخلايا. الآن ، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسكب المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الحفظ بالتبريد.
بعد ذلك ، انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى قارورة مبردة سعة 1.2 ملليلتر. ضع القوارير المبردة في وعاء تجميد وقم بتجميدها طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. نقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
لإذابة القوارير المجمدة ، قم أولا بتسخين وسط الاستزراع في حبات معدنية يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية ، واملأ مسبقا 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الدافئ في أنبوب سعة 15 ملليلتر. الآن ، قم بإزالة القوارير المبردة من النيتروجين السائل وضعها في نظام ذوبان آلي للذوبان السريع. قم بإسقاط 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسط الاستزراع المسخن مسبقا في القارورة المبردة لضمان التكيف التدريجي للخلية.
ثم ، ماصة 1.5 إلى 2 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر مع متوسط. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من الوسط الدافئ. قم بتحميل الخلايا في مقياس الدم وعدها لتحديد معدلات الشفاء والبقاء على قيد الحياة. استزرع الخلايا المذابة على الألواح المطلية بالغشاء القاعدي في وسط استزراع باستخدام Y27632.
أظهرت الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين التي تم تجميدها في اليوم الخامس في مرحلتها الأسية معدل ارتباط أعلى بعد الذوبان. بالنسبة إلى مورفولوجيتها السداسية المميزة ، كان للخلايا المجمدة في نقاط زمنية أخرى نمط ظاهري ليفي. أظهرت خلايا P2 اليوم الخامس تعبيرا أعلى وعلامات خلايا موضعية بشكل أكثر ملاءمة بعد 28 يوما من الذوبان.
ولوحظ أن وسائط الحفظ بالتبريد المختلفة كان أداؤها جيدا بنفس القدر في تحقيق قابلية عالية للبقاء والتعلق بعد الذوبان.