للبدء ، قم بتغطية طبق بئر صغير ب 150 ميكرولتر من محلول مرفق الخلية من 0.01٪ إلى 0.1٪ قبل الحضانة. بمجرد أن يجف الطبق بالهواء ، أضف 80 ميكرولترا من محلول جزيئات النانو الذهبية بالتنقيط على السطح الجاف. في اليوم التالي ، قم بإزالة أي وسيط استزراع مضاف من البئر الصغير.
ثم أضف ملليلتر من الخلايا المنقولة فوق جزيئات النانو الذهبية المجمدة على سطح الزجاج. احتضان اللوحة قبل بدء التجربة. استخدم مجهرا متحد البؤر مع جهاز ليزر مضبوط على 488 نانومتر لعرض مضان GFP من بروتين الملحق.
اضبط ليزر نيون الهيليوم على 633 نانومتر لمراقبة انعكاس جسيمات الذهب النانوية. اختر خلايا مفردة بدلا من مجموعات الخلايا لمنع تداخل أغشية البلازما. تأكد من أن جزيئات الذهب النانوية الثابتة موجودة كجسيمات مفردة ومتباعدة بشكل كاف لمنع زيادة التدرج الحراري.
استخدم الملقط البصري لتشعيع جسيم الذهب النانوي لمدة ثانية واحدة لتعطيل غشاء البلازما. لتوليد حويصلات أحادية الصفيحة عملاقة أو GUV ، ضع 90 ميكرولترا من جل PVA الدافئ 5٪ على شريحة زجاجية. انشر الجل بشكل موحد على الشريحة.
ثم اترك الشريحة تجف في خزانة تسخين عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. بعد ذلك ، استخدم حقنة زجاجية لتطبيق 30 ميكرولترا من خليط الدهون. باستخدام حافة الإبرة ، انشر الخليط في طبقة رقيقة.
ضع تدفقا لطيفا من غاز النيتروجين لتبخير الكلوروفورم في خليط الليبيد. ثم جفف الشرائح تحت فراغ لمدة 1.5 إلى 2 ساعة. في أنبوب منفصل 2 ملليلتر ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتنامي.
ثم أضف البروتين المؤتلف الذي يهمك إلى تركيز نهائي قدره 500 نانو مولار. ماصة 400 ميكرولتر من البروتين المخفف إلى الغرفة المجمعة في المنزل ، ولف الغرفة في PERIFIL. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، انقل 400 ميكرولتر من محتوى الغرفة إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر.
أضف ملليلتر واحد من محلول المراقبة إلى المحلول الذي تم جمعه لإزالة أي بروتينات غير مغلفة. ثم الطرد المركزي الحل في 600 غرام لمدة 10 دقائق عند 13 درجة مئوية. بعد ذلك ، استبدل ملليلترا واحدا من المادة الطافية بمخزن مؤقت للمراقبة وماصة برفق لتفريق GUVs.
برد حتى بداية التجربة. لثقب GUV ، قم أولا بتغطية سطح طبق سفلي زجاجي 35 ملم مع بيتا كازين. بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولتر من قذائف نانو الذهب 150 نانومتر إلى خليط GUV الذي يحتوي على كلوريد الكالسيوم.
نقل الخليط إلى الغرفة وتثبيته على مرحلة المجهر. استخدم الملقط البصري لاحتجاز غلاف نانو ذهبي فردي على سطح GUV. عندما يكون الغلاف النانوي المحاصر على اتصال وثيق بغشاء GUV ، قم بزيادة طاقة الليزر لثقب الموقع المستهدف.
أدى تشعيع الجسيمات النانوية إلى إصابة الغشاء وتسبب في التوظيف السريع للملحقات إلى موقع الإصابة ، بعد تدفق الكالسيوم لتشكيل هيكل يشبه الحلقة. في تجارب GUV ، تم إعادة إغلاق ثقب الغشاء بسرعة في غياب المرفقات. أدت الخصائص الفيزيائية الحيوية الفريدة لبروتين annexin A 4 إلى انفجار GUV بسبب قدرته على لف الأغشية.
تسبب وجود الملحق في GUVs في تراكم سريع في موقع الإصابة ، بعد ثقب الغشاء. أظهر تحليل الملحق A 5 حلقات في تجارب الخلية أنها ظلت ثابتة عبر الزمان والمكان. تسبب اضطراب غشاء البلازما باستخدام البلازمونات الحرارية في ارتفاع مستويات أيونات الكالسيوم.
وصلت الخلايا إلى أقصى كثافة للكالسيوم في 6.6 ثانية ، وهي نقطة زمنية يفترض أنها تتوافق مع وقت إغلاق الجرح.
