للبدء ، سخن رؤوس بعوض الأنوفيلة التي تم تشريحها في محلول CCD عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة خمس دقائق. انقل الأنبوب مع رؤوس البعوض إلى فرن تهجين للدوران عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل محتوى الأنبوب بالكامل إلى زجاج ساعة تشريح.
باستخدام الملقط ، التقط الرؤوس أو أي هوائيات منفصلة وقم بتثبيتها في ملليلتر واحد من التثبيت المسبق. في nutator ، قم بتدوير الرؤوس في المثبت المسبق لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. لإجراء تشريح الأنسجة ، أولا ، شطف الرؤوس مع ملليلتر واحد من 0.1 ٪ PBS-Tween على الجليد.
ثم انقل الرؤوس إلى زجاج ساعة تشريح. تحت المجهر تشريح ، وإزالة الأنسجة ذات الأهمية من الرأس مع ملقط حاد. امسك الجزء الأمامي من الرأس بالملقط وأمسك بهوائيا بملقط آخر من القاعدة.
وبالمثل ، قم بإزالة الجس. نقل الهوائيات والجس إلى أنابيب فارغة خالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي موضوعة على الجليد. تجفيف الأنسجة في 400 ميكرولتر من كاشف التجفيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم استبدل كاشف التجفيف ب 400 ميكرولتر من الميثانول المطلق والأنسجة المجففة طوال الليل عند 20 درجة سلزية تحت الصفر. بعد اكتمال التثبيت ، أعد ترطيب الأنسجة في سلسلة من أربع خطوات من محاليل إعادة الترطيب المتدرجة لمدة 10 دقائق على الثلج. ثم اغسل الأنسجة في 400 ميكرولتر من PBST لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
احتضان الأنسجة في 400 ميكرولتر من محلول البروتيناز K لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأنسجة مرتين في 400 ميكرولتر من PBST لوقف الهضم الأنزيمي. بعد إضافة المثبت اللاحق ، اغسل المنديل باستخدام PBST مرة أخرى قبل تهجين المسبار.
اغمر الأنسجة في 400 ميكرولتر من مخزن تهجين المسبار لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت وتهجين الأنسجة مسبقا في 400 ميكرولتر من محلول تهجين المسبار المسخن مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استبدل المخزن المؤقت لتهجين المسبار المسخن مسبقا ب 400 ميكرولتر من محلول المسبار الساخن.
ضع الأنبوب في نوتيتور لمدة ليلتين عند 37 درجة مئوية. ثم ضع nutator داخل حاضنة مغطاة في صندوق. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة في 400 ميكرولتر من محلول غسيل المسبار عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
بعد غسل الأنسجة في 5x SSCT ، احتضان في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماصة خارج المخزن المؤقت للتضخيم من الأنبوب. ثم أضف مزيجا من دبابيس الشعر الساخنة ، H1 و H2. بعد ذلك ، ماصة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم.
قم بتقطيع المنديل طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة. لتركيب الأنسجة ، ضع أولا خمس قطرات من محلول التركيب على شريحة زجاجية. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، احصل على عينات الأنسجة المغسولة من قاعدتها.
اغمر بلطف وشطف في سلسلة من قطرات الحل المتصاعدة. ثم قم بالتركيب بمحلول التثبيت وضع غطاء على المنديل. أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر قبل التصوير.
كشفت تحليلات HCR fiche للأنسجة الشمية لبعوضة الأنوفيلة الأنثوية أن IR 41t1 و IR75d و IR7t كانت أقل وفرة في الهوائيات. كان IR64a أكثر وفرة بثلاث مرات من بقية الجينات المرشحة. لوحظ التوطيني المشترك لعائلات مستقبلات orco و IR25a في الهوائي وكذلك في ملامسة الفك العلوي للبعوض.
تشير أنماط التوطين المشترك إلى أن الخلايا الإيجابية IR76b تعبر عن IR25a ، في حين أن الخلايا الإيجابية IR8a تتمركز جزئيا مع IR76b و IR25a.
