للبدء ، أضف 500 ميكرولتر من جل الثقافة الدافئة إلى بئر في طبق 24 بئرا. انقل بسرعة القواطع الكاملة المشرحة المعزولة من الماوس إلى البئر. قم بتدوير اللوحة عدة مرات لشطف القواطع.
أضف 400 ميكرولتر من جل الثقافة الدافئ إلى طبق الثقافة ونقل القواطع المغسولة إلى الطبق. قم بتوجيه القاطعة لوضع منطقة حلقة عنق الرحم في وسط الطبق وضبط إمالة القاطعة القمية لمستوى التصوير المطلوب. بمجرد ضبط الجل ، باستخدام زوج من الملقط الناعم ، قم بإزالة أي هلام أعلى المنطقة محل الاهتمام.
أضف ما يقرب من 150 ميكرولترا من وسائط الثقافة الدافئة على حافة الطبق لتغطية العينة. ضع مزرعة الزرع عند 37 درجة مئوية للسماح للأنسجة بالاستقرار. بعد ساعة واحدة ، قم بتشغيل المجهر والليزر ثنائي الفوتون.
ثبت طبق الاستزراع بمحول المسرح وضع حلقة محول الوفرة في الأعلى. قم بتوصيل محول المسرح بجهاز تحكم في درجة الحرارة للحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية. قم بتوصيل مدخل ومخرج حلقة المحول بمضخة microprofusion.
اضبط سرعة الوفرة على 20 وابدأ وفرة الوسط على العينة. ضع ACBR أعلى حلقة المحول وارفع المسرح بحيث يتناسب الهدف من خلال ACBR للاتصال بوسط الاستزراع. أدر الطول الموجي لليزر إلى 920 نانومتر لتصور GFP.
بعد تحديد موقع العينة من خلال العدسة ، قم بتصورها باستخدام برنامج المجهر ، ثم قم بإعداد حجم Z-step من أربعة ميكرومتر وفاصل زمني مدته خمس دقائق لمدة 14 ساعة. ابدأ تصوير الفاصل الزمني واحفظ الملفات اللاحقة لتحليل البيانات النهائية. في المجهر الفاصل الزمني من K14-Cre ؛ R26-rtTA ؛ حلقة عنق الرحم tetO-H2B-GFP ، لوحظت إشارات H2B-GFP في الغالب في منطقة التضخيم العابر لحلقة عنق الرحم ، مما يشير إلى انقسامات الخلايا النشطة.
علاوة على ذلك ، لوحظ تكثيف ومحاذاة الكروموسومات عند صفيحة الطور في الخلايا الانقسامية متبوعا بفصلها أثناء الطور وإلى خليتين ابنتين. كانت معظم الانقسامات الخلوية متعامدة أو بزاوية مائلة بالنسبة للغشاء القاعدي مع عدد أقل من الانقسامات الأفقية الموازية للغشاء القاعدي. كانت أحداث انقسام الخلايا واضحة أيضا في K14-Cre. حلقات عنق الرحم R26-mT / mG حيث تم تمييز جميع أغشية الخلايا الظهارية باللون الأخضر.
تم التعرف على الخلايا الميتوزية من خلال تقريب الخلايا والتحلل الخلوي اللاحق. في K14-Cre ؛ حلقات عنق الرحم R26-mT / mG ، كما لوحظت انقسامات الخلايا الأفقية والرأسية.
