Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

للبدء ، قم بإعداد لوحة أغاروز 1.8٪ باستخدام وسيط HEPES Buffered E3 أو E3. أثناء العمل تحت مجهر التشريح ، ضع ستة إلى 10 يرقات مخدرة على التوالي على صفيحة الأغاروز. ضع دبوس حشرة واحد على رأس كل يرقات. ثم قم بإزالة E3 المتبقية من اللوحة باستخدام منديل.

باستخدام دبوس حشرة آخر ، اعزل الأمعاء عن اليرقات دون إزعاج أي أعضاء أخرى. ضمان الإزالة المناسبة للصفار. بمجرد عزلها ، افحص الأمعاء وقم بإزالة جميع المواد غير المعوية ، مثل الجلد أو الدهون أو الكبد.

استخدم الملقط لجمع الأمعاء ونقلها إلى برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ FCS في أنبوب طرد مركزي دقيق يوضع على الجليد. مباشرة بعد تشريح جميع الأمعاء ، الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي الدقيق في 13،800 غرام لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية ، وترك حوالي 100 ميكرولتر في الأنبوب لمنع الأمعاء من الجفاف.

أضف 500 ميكرولتر من محلول غراء إلى الأمعاء في الأنبوب. تنشيط غراء عن طريق إضافة 2.5 ميكرولتر من السيستين المولي واحد. ثم احتضان الأنبوب الذي يحتوي على الأمعاء في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ماصة المحتويات صعودا وهبوطا في منتصف الطريق بعد خمس دقائق لتحفيز هضم الأنسجة الأنزيمية. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، أو FACS ، من خلال مصفاة خلية 35 ميكرون ملصقة مسبقا. اغسل المصفاة عدة مرات بإضافة 0.5 ملليلتر من PBS تحتوي على 10٪ FCS إلى إجمالي حجم غسيل يبلغ 2 ملليلتر.

أجهزة الطرد المركزي الترشيح التي تم جمعها عند 700 غرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة الطاف. أضف ميكروغرام واحد لكل مليلتر DAPI إلى 300 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10٪ FCS. أضف هذا الخليط إلى الحبيبات وأعد تعليقه لتسمية الخلايا الميتة.

ثم احتضانها لمدة خمس دقائق على الجليد للسماح باستبعادها أثناء تحليل FACS اللاحق.