لتطوير طريقة LC-TIMS ToF MS / MS لتحليل ببتيدات الهستون المحللة للبروتين ، قم بإقران HPLC المزود بعمود C-18 مع أداة TIMS ToF MS التجارية مع تقنية سلبية خاصة. بعد ذلك ، اضبط ظروف تشغيل التأين بالرش الكهربائي النانوي على 4 ، 500 فولت جهد شعري ، إزاحة لوحة نهاية 800 فولت ، ضغط البخاخات ثلاثة بار ، 10 لترات في الدقيقة غاز جاف ، وسخان جاف 200 درجة مئوية. قم بتكوين إعدادات MS لطاقة تصادم ستة إلكترون فولت ، وتردد تصادم 1200 VPP ، ووقت نقل 75 ميكروثانية ، وتخزين ما قبل النبض بخمسة ميكروثانية.
اضبط حجم الحقن على 20 ميكرولتر ، أي ما يعادل ثمانية ميكروغرام من العينة ، واضبط معدل التدفق على 0.4 ملليلتر في الدقيقة. بعد إدخال الجدول الزمني المحدد للتدرج وتجربة الأسيتونيد بنسب 0.1٪ من حمض الفورميك ، حدد موافق في كلا المربعين المنبثقين لحفظ الطريقة. قم بتشغيل تدرج LC غير خطي لمدة 60 دقيقة باستخدام الماء والأسيتونيتريل ، وكلاهما يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك.
تحقق من شطف العينة من HPLC إلى TIMS ToF عبر التأين بالرش الكهربائي النانوي في وضع التأين الإيجابي. لتحديد تسلسل الببتيد ومواقع التعديل تحت أداة MS-Digest ، قم بإنشاء قائمة نظرية بالببتيدات باستخدام Protein Prospector. بعد ذلك ، قم بإجراء ملخص نظري مع مراعاة ظروف الهضم ، ونوع التعديلات اللاحقة للترجمة ، ونطاق حجم الببتيد ، ونطاق الكشف الشامل ، والعدد المحتمل للانقسامات المفقودة.
لتحليل البيانات المكتسبة ، ابحث عن الكتل في عدة حالات شحن ، تتراوح من زائد واحد إلى زائد أربعة ، لكل ببتيد نظري. بعد تحديد كل كتلة إلى نسبة الشحن ، حدد الذروة وقم بتأكيد MSMS باستخدام قائمة نظرية لأيونات التجزئة بناء على تسلسل الببتيد. بما في ذلك تعديلات ما بعد الترجمة.
كشفت أطياف تجزئة الببتيدات عن ثلاثة أنواع مختلفة من الببتيد مع تعديلات مختلفة بعد النسخ ، بما في ذلك مجموعات البروبيونيل والأسيتيل ، في مواضع مختلفة. أظهر معيار هيستون بروبيونيل H3 ببتيدات أطول من النسخة غير المعدلة. أظهرت الهستونات المستخرجة من خلايا HeLa S3 أنماطا متعددة من التعديل بعد الترجمة في نفس مواضع الأحماض الأمينية.
