Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

151 Views

•

02:37 min

•

November 10th, 2023

DOI :

10.3791/200882-v

November 10th, 2023

•

Christina M. Kaszuba¹^,², Benjamin J. Rodems¹^,³, Sonali Sharma¹^,³, Edgardo I. Franco¹^,², John M. Ashton¹^,³^,⁴, Laura M. Calvi¹^,⁵, Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Transcript

للبدء ، قم بإزالة الأنسجة من عظام الفأر تشريح القتل الرحيم. ضع العظام النظيفة في صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على مخزن مؤقت FACS موضوع على الثلج. نقل العظام إلى هاون مع اثنين إلى خمسة ملليلتر من العازلة FACS.

طحن العظام في حركة دائرية حتى يتم تحرير نخاع العظام. باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر ، اسحب نخاع العظم لأعلى واغسله لأسفل لتجانسه. اسحب التجانس إلى حقنة أخرى ، ثم قم بترشيحه من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر.

اشطف قطع الأنسجة من مرشحها مرة أخرى إلى الهاون باستخدام مخزن FACS المؤقت قبل التجانس مرة أخرى. تصفية الأنسجة المغسولة كما كان من قبل. بعد ذلك ، اشطف الشبيكات العظمية المتبقية مرة أخرى في الهاون باستخدام المخزن المؤقت FACS.

ثم اغسل القطع في أنبوب سعة 15 ملليلتر لضمان أقصى عائد. لهضم نخاع العظم ، قم أولا بطرده عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات نخاع العظم في ملليلتر من خليط الهضم.

نقل الخليط إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على المدور. الآن ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS لوقف الهضم الأنزيمي.

قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 400 G لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء.

بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS لوقف التحلل. ثم قم بتصفية الخليط كما كان من قبل في أنبوب 50 ملليلتر. أخيرا ، قم بطرد الخليط عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. لهضم الشويكات العظمية ، أولا ، دوامة الشويكات العظمية. صب الطافد والاحتفاظ بالعظام في القاع.

بعد ذلك ، أعد تعليق الشويكات في ملليلتر واحد من خليط هضم الشويكات العظمية. احتضان الأنبوب على دوار لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، أوقف عملية الهضم باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS.

قم بتصفية الخليط في أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على نخاع العظم المحسول والمهضوم RBC.

Explore More Videos