للبدء ، استخدم ملقط لإزالة أي دهون ونسيج ضام من الغدة اللعابية تحت الفك السفلي المشرحة للفأر الرحيم. ثم ضع الغدة في أنبوب تجميع مع محلول HBSS بارد الثلج. بعد ذلك ، استخدم ملقط لقطع الغدة إلى قطع سنتيمتر مربع واحد.
تسخين 4 ٪ agarose إلى 50 درجة مئوية ، وسكب الحل في طبق 35 ملم. صب كمية صغيرة من محلول الأغاروز في طبق منفصل وإضافة قطع الغدة فيه. ثم قم بتدوير القطع في الأغاروز الزائد لتغطيتها.
المكان التالي أربع إلى ست قطع من الغدة مسطحة في الطبق الأول مع agarose. ضع الغطاء على الطبق وانقله إلى صندوق ثلج ، وقم بتغطية الطبق بالثلج ليبرد ويثبت. لتقسيم قطع الغدة ، استخدم أولا مشرطا لقطع كتلة الأغاروز المضمنة في الغدة بعناية.
بعد ذلك ، ضع قطرة من الغراء الفائق على كتلة الأغاروز وأرفقها بمرحلة الاهتزاز. الآن ملء غرفة الاهتزاز مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد يحتوي على 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين. باستخدام مشرط ، قم بقص أي أغاروز زائد وخلق فجوات خمسة ملليمترات بين كل قطعة من الغدة.
قم بمحاذاة شفرة الاهتزاز مع كتلة الأغاروز واضبط نقطتي البداية والنهاية للأقسام. قطع كتلة الأنسجة إلى أقسام بسمك 150 ميكرومتر بسرعة منخفضة واهتزاز عالي. بمجرد قطع المقاطع ، استخدم فرشاة الرسم لالتقاط الشرائح ووضعها في طبق به وسائط RPMI مسخنة مسبقا تحتوي على المضادات الحيوية.
لاستزراع الشرائح تحت الفك السفلي ، أولا ، أضف 1.5 ملليلتر من وسائط RPMI إلى آبار صفيحة ستة آبار. ضع مرشحات 0.4 ميكرومتر في الآبار. بعد ذلك ، بمساعدة فرشاة الرسم ، انقل بعناية شريحة إلى ست شرائح على كل مرشح.
ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ثاني أكسيد الكربون. بعد تشعيع بعض الصفائح التجريبية بأشعة جاما للحث على الإصابة ، أعد الألواح إلى الحاضنة. بعد ذلك ، املأ آبار 24 صفيحة بئر ب 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع.
باستخدام فرشاة الرسم ، ارفع الشرائح من الفلتر واغمرها برفق في الآبار. احتضان الشرائح في البقع النووية ذات الصلة. ثم احتضان الشرائح بالأجسام المضادة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة اللطيفة.
اغمر الشرائح في وسائط الثقافة ثلاث مرات لغسلها. دع الشرائح تحتضن في كل محلول غسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت التحريك اللطيف. بعد ذلك ، استخدم ملقط لإزالة الشريط من فاصل التصوير على الوجهين.
قم بلصق الفاصل في الجزء السفلي من لوحة بئر ذات ستة قاع زجاجي ، ثم ماصة 50 ميكرولترا من الوسائط في الفجوة الموجودة في وسط الفاصل. ضع الشريحة في الوسائط مع التأكد من وضعها بشكل مسطح. ثم باستخدام ماصة ، قم بإزالة 20 ميكرولترا من الوسائط بعناية من الفجوة.
استخدم الملقط لإزالة الشريط بعناية من الجانب العلوي للفاصل ووضع غطاء دائري 25 ملم فوقه. اضغط حول حواف الفاصل لضمان التثبيت القوي لانزلاق الغطاء. تخيل الشريحة على مجهر متحد البؤر.
احتفظت الشرائح غير المشععة من الغدة تحت الفك السفلي المستزرعة لمدة سبعة أيام بإشارة MT والهندسة الظهارية. ومع ذلك ، في ثلاثة أيام بعد التشعيع ، لوحظ ضمور الخلايا العنيبية والقنوية. شوهدت خلايا إيجابية Caspase في أربعة أيام بعد التشعيع.
لوحظ ارتفاع غاما H2AX في شرائح مشعة ، مما يدل على تلف الحمض النووي في الجسم الحي. أكد التصوير في الوقت الحقيقي للبلاعم البلعمة للخلايا الظهارية في نموذج زراعة الشرائح. يمكن اكتشاف الخلايا الفردية وتجزئتها للتحليل اللاحق لسلوك الخلية ، مثل الهجرة.
