بعد تشغيل المجهر متحد البؤر المجهز بأهداف غمر الزيت 40x و 63x ، ضع الشريحة على مرحلة المجهر. لتصوير أسلاف العضلات المرتبطة بقرص الجناح وعضلات الطيران غير المباشرة أو IFMs ، اضبط DAPI بإثارة 405 وانبعاث 450 نانومتر. ثم حدد Alexa Fluor 488 بإثارة 496 وانبعاث 519 نانومتر ، و Quasar 670 لتحقيقات smFISH بإثارة 647 وانبعاث 670 نانومتر.
حدد موقع العينة باستخدام إشارة DAPI ومصباح الأشعة فوق البنفسجية. احفظ الصور الملتقطة كملفات TIFF. لتصوير الخلايا الجذعية للعضلات البالغة ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ل DAPI و Alexa Fluor 488 كما هو موضح سابقا.
ثم اضبط الأطوال الموجية ل Alexa Fluor 555 و Quasar 670 لتحقيقات smFISH. حدد موقع العينة واحفظ الصور الملتقطة بتنسيق TIFF. قم بتشغيل الصورة J وانتقل إلى قائمة المكونات الإضافية.
حدد وحدات الماكرو، ثم تحرير لفتح التعليمات البرمجية المصدر لوحدات الماكرو. لتحديد بقع Mef2 smFISH في اليرقات ، اضبط نصف قطر السجل على ثلاثة وجودة السجل على 20. ثم قم بتقسيم النوى الموجبة Mef2 مع طمس اثنين ، ومعلمة مقياس النواة 30 ، وعتبة النواة سالب ثمانية ، وحجم النواة 300.
ابدأ الماكرو عن طريق تنفيذ أمر التشغيل. سيقوم الماكرو تلقائيا بتحميل جميع الصور من المجلد المعين وتحديدها بالتتابع. في ألياف العضلات ، اضبط نصف قطر اللوغاريتم على 2.5 ، وجودة السجل على 60 ، والتمويه على اثنين ، ومعلمة مقياس النواة على 100 ، وعتبة النواة على الصفر ، وحجم النواة على 300.
ابدأ الماكرو عن طريق تنفيذ أمر التشغيل. سيقوم الماكرو تلقائيا بتحميل جميع الصور من المجلد المعين وتحديدها بالتتابع. بعد التحليل ، تحقق من النتائج المعروضة في نتائج ملف FISH ونتائج نوى الملف.
تم الكشف عن نسخ Mef2 و Zfh1 بشكل موحد في مجتمع AMP وتمت مشاركتها مع بروتينات Mef2 و Zfh1 على التوالي. تميز تكبير أعلى ل AMPs بين بؤر مواقع النسخ و mRNA الناضجة المنتشرة في السيتوبلازم. وبالمثل ، تم فحص موقع النسخ وتوزيع Mef2 و Zfh1 mRNA في IFMs البالغة المتمايزة والخلايا الجذعية المرتبطة بها.
اكتشفت الصورة J ماكرو المدمجة داخليا بشكل فعال وقسمت بقع Mef2 ونوى العضلات. لم يكن التحليل الكمي ل Mef2 mRNA لكل نواة في IFMs البالغة و AMPs مختلفا بشكل كبير. أظهر القياس الكمي للتوزيع الموضعي Mef2 أن 92٪ من Mef2 mRNA موجود في السيتوبلازم ، و 8٪ مرتبط بنوى العضلات.
