إعداد Lentivirus وإعادة برمجة نقل لخلايا سرطان البنكرياس الغدي القنوي

1 2 للبدء ، انظر خلايا HEK 293T3 قبل 24 ساعة من التعدي 4 في طبق 15 سم يحتوي على GMEN. 5 احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية 6 و 5٪ ثاني أكسيد الكربون 7 حتى تصل إلى 40 إلى 50٪ التقاء. 8 قم بتسمية ثلاثة أنابيب بلاستيكية سعة 15 مليلتر 9 باسم فيروس العدسات المناسب.

10 أضف 1.710 مل من وسط المصل المختزل 11 و 90 ميكرولتر من كاشف التعدي إلى كل أنبوب. 12 امزج المحتويات عن طريق دوامة 13 قبل احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة. 14 بعد خمس دقائق ، أضف خليط ناقل العبوة 15 إلى وسط الإرسال والدوامة.

16 ثم أضف 7.5 ميكروغرام من متجه إعادة البرمجة 17 وعنصر التحكم pWPT-GFP 18 إلى خليط التعداء المعني. 19 دوامة الأنابيب لمدة ثانيتين 20 قبل احتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 21 لنقل خلايا 293T مع كل فيروس عدسي ، 22 بالتنقيط ، أضف خليط الحمض النووي الشفاف إلى الطبق.

23 احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية 24 و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. 25 بعد 14 إلى 16 ساعة ، 26 استبدل الوسط ب 30 مل 27 من 293T المتوسط الطازج 28 واستمر في الحضانة لمدة 60 إلى 72 ساعة. 29 راقب الخلايا يوميا 30 وتحقق من كفاءة التعداد.

31 بعد ذلك ، انقل ثقافة تعداء الفيروس 32 إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر 33 وتدور عند 1 ، 932 جم لمدة 10 دقائق 34 عند أربع درجات مئوية. 35 قم بتصفية المادة الطافية للعدسات 36 باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرون 37 في أنبوب جديد سعة 50 مل. 38 قبل يوم واحد من انتقال الفيروس ، 39 قم بإعداد بئرين من صفيحة مكونة من 6 آبار 40 تحتوي على 100،000 خلية PDAC لكل بئر.

41 قم بإعداد أنبوبين سعة 15 مليلتر 42 مع ملليلترين من وسط PDAC الدافئ مسبقا. 43 في الأنبوب الأول ، 44 يضيف 12 ملليلترا من فيروس العدسات المعاد برمجته. 45 ثم أضف 12 ميكرولترا من البوليبرين 46 واخلطها عن طريق سحب العينات.

47 إلى الأنبوب الثاني ، 48 أضف ميكرولترين من البوليبرين. 49 الآن قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر 50 من 6 آبار من اللوحة 51 واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة. 52 أضف وسط إعادة برمجة العدوى 53 من الأنبوب الأول إلى البئر الأول.

54 نضيف الخليط من البئر الثاني إلى البئر الثاني. 55 احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية 56 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 5٪ أكسجين. 57 في اليوم التالي ، استبدل الوسط 58 من كلا البئرين بمتوسط PDAC 59 الطازج واستمر في الحضانة 60 لمدة تصل إلى 48 ساعة كما هو موضح.