تحضير الخلايا المغذية iMEF وإعادة برمجة التحويل للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

1 للبدء ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار2 بملليلترين من محلول الجيلاتين 0.2٪ لكل بئر. 3 احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية 4 و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. 5 بعد ذلك ، أضف iMEFs في أنبوب سعة 15 مليلتر 6 يحتوي على 10 ملليلتر 7 من وسط الخلايا الليفية البشرية الدافئة مسبقا ، 8 واخلطها عن طريق قلب الأنبوب برفق.

9 جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 309 جم لمدة ثلاث دقائق. 10 وقم بإزالة المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات 11 في 12 مل من وسط الخلايا الليفية البشرية. 12 ضع ملليلترين من معلق الخلية 13 في كل بئر من ستة ألواح الآبار المطلية بالجيلاتين.

14 وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية 15 و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. 16 تخلص من الوسط من 17 المصابة بفيروس العدسي و PDAC غير المصابة ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. 18 ثم أضف 500 ميكرولتر من التربسين لفصل الخلايا.

19 وتحتضن عند 37 درجة مئوية 20 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 5٪ أكسجين 21 لمدة 15 دقيقة. 22 الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق. 23 وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط PDAC.

24 اغسل لوحة iMEF بوسيط PDAC. 25 ثم أضف 50،000 خلية PDAC مصابة بفيروس العدسات 26 لكل بئر في خمسة آبار من لوحة iMEF ، واحتضنها بين عشية وضحاها 27 كما هو موضح سابقا. 28 بعد تحضير وسيط إعادة البرمجة ، أضف 29 100 ميكرولتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية من 30 إلى 100 مل من وسط إعادة البرمجة.

31 في اليوم التالي ، اغسل الخلايا التي تنمو على مغذيات iMEF مرتين 32 باستخدام وسائط إعادة برمجة مسبقة التسخين. 33 ثم أضف ملليلترين من الوسائط إلى كل بئر ، 34 واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية 35 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 3٪ أكسجين. 36 بعد اجتياز تجمع IPSC خمس مرات ، لاحظ 37 المستعمرات القوية 38 التي تحافظ على مورفولوجيا شبيهة ب ESC.

39 أظهر PDAC و BxPc3 و 40 H6c7 والخلايا الليفية البشرية 41 أياما مختلفة من إعادة البرمجة 42 لتشكيل مورفولوجيا ناضجة تشبه ESC. تم إنشاء 43 خطا نسيلي IPSC 44 من كل إعادة برمجة PDAC و 45 BxPc3 و H6c7 و 46 والخلايا الليفية البشرية. 47 جميع خطوط IPSC المنشأة ملطخة بشكل إيجابي 48 ل TRA-160 ، مما يؤكد إعادة برمجتها إلى تعدد القدرات.