Tissue Embedding and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

للبدء ، اعزل الأذين الأيسر والأوردة الرئوية أو PVs عن قلب الفأر. ضع الأنسجة المعزولة في جهاز تبريد بحيث تكون قاعدة القلب وقمة الرئة متجهة لأعلى. قم بفك وفك تشابك PVs في حالة تعقدها.

ثم املأ cryomold بمركب OCT. باستخدام ملقط دقيق ، قم بالضغط اللطيف على الخلايا الكهروضوئية دون تحريكها لإزالة الهواء المتبقي. قم بتجميد الأنسجة في مركب OCT على الثلج الجاف.

للتلطيخ المناعي ، قم بإذابة شرائح الماوس الكهروضوئية المجمدة على نظام تلطيخ لمدة 20 دقيقة. ثم ضع عدة قطرات من محلول تثبيت بارافورمالدهايد بنسبة 4٪ على الأقسام لتثبيت الأنسجة على الشريحة. بعد الحضانة ، انقل الشرائح إلى رف عمودي واغمرها في حاوية مملوءة ب PBS.

اضبط الحاوية على شاكر بطيء لمدة خمس دقائق لشطف الشرائح. باستخدام قلم مانع سائل يحتوي على زيلول ، قم بتطويق كل قسم على كل شريحة. وإعادة تنظيم الشرائح على نظام تلطيخ.

باستخدام ماصة باستور ، ضع قطرة أو قطرتين من محلول النفاذية على كل عينة. بعد ذلك ، قم بتنظيف محلول Triton X-100 عن طريق غسل الشرائح لمدة خمس دقائق في PBS. بعد إعادة ترتيب الشرائح على نظام التلوين ، أضف قطرة أو قطرتين من المخزن المؤقت للحظر إلى كل قسم ، مما يضمن تغطية كاملة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ملليلتر واحد من مزيج الأجسام المضادة الأولية الذي يتكون من الأجسام المضادة الأولية وحاجز الحظر. تجاهل المخزن المؤقت لحجب البقايا من الشريحة. تطبيق قطرتين أو ثلاث قطرات من خليط الأجسام المضادة الأولية لكل قسم.

بعد الحضانة ، ضع الشرائح في رف عمودي وشطف الشرائح لمدة خمس دقائق في المخزن المؤقت للغسيل مع الحفاظ على التحريك اللطيف. بعد ذلك ، قم بإعداد ملليلتر واحد من مزيج الأجسام المضادة الثانوية التي تتكون من الأجسام المضادة الثانوية ومخزن الغسيل. أعد وضع الشرائح على نظام التلوين واستخدم ماصة لتوزيع قطرتين أو ثلاث قطرات من مزيج الأجسام المضادة الثانوية على كل قسم.

بعد ذلك ، قم بتنظيف الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في مخزن مؤقت للغسيل أثناء الرج. بعد ذلك ، أضف قطرتين أو ثلاث قطرات من محلول Hoechst 33342 إلى كل قسم مرتب على نظام التلطيخ. ضع الشرائح في رف عمودي واشطفها لمدة خمس دقائق في مخزن مؤقت للغسيل مع تحريك لطيف.

أضف قطرة أو قطرتين من وسيط تركيب الفلورسنت إلى كل شريحة وأغلق الشرائح بزلات الغطاء. لوحظت منطقة فتحة الوريد الرئوي عند الأذين الأيسر وتقاطع الوريد الرئوي والأوردة خارج الرئة والأوردة بين الرئة تحت تكبير 10X. لوحظت إشارات cTnT محددة مع تشقق عضلي نموذجي في فتحة الوريد الرئوي والأوردة خارج الرئة والأوردة داخل الرئة عند تكبير 40X.

تم العثور على Cx43 في جميع المناطق الرئوية الثلاث وتم إسقاطه بشكل أساسي بين خلايا عضلة القلب المجاورة. لوحظت إشارات مرتبطة ب Cx43 على الجانب القطبي والجانب الجانبي من خلايا عضلة القلب في أكمام عضلة القلب.