للبدء ، ضع غطاء زجاجي 25 ملم ينزلق في آبار صفيحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار. ضع قطرة من البوليسين في وسط كل زلة غطاء. بعد اكتمال الحضانة ، اغسل كل غطاء ثلاث مرات بالماء المقطر.
ثم اغسل الغطاء ينزلق مرتين بمحلول ملحي خال من الكالسيوم. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأغطية في غرفة التسجيل واملأها بمحلول ملحي خال من الكالسيوم. اجمع يرقات النجم الثالث المتجول من الصليب الجيني المطلوب لذبابة الفاكهة.
نقل اليرقات إلى طبق جيد ، ثم غسل اليرقات ثلاث مرات بالماء المقطر. ضع اليرقات في طبق تشريح زجاجي آخر يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول ملحي بارد وخالي من الكالسيوم. الآن ضع يرقات تحت مجهر ستيريو.
باستخدام زوج من الملقط ، قم بعمل قطع عرضي عبر الجزء الخلفي من البطن. ادفع الفك بالملقط لتحويل اليرقات من الداخل إلى الخارج. راقب الحبل العصبي البطني بجوار الفك.
قم بإزالة الأقراص الوهمية وأنسجة الدماغ المتبقية بعناية. بعد ذلك ، افصل الحبل العصبي البطني مع الدماغ المركزي والفصوص البصرية عن بقية الأنسجة. انقل الحبل العصبي البطني إلى غرفة التسجيل التي تحتوي على محلول ملحي خال من الكالسيوم.
لتجنب التداخل ، قم بتوصيل الأعصاب المتبقية بأسفل الغطاء باستخدام ملقط. لإجراء تجارب على الأجسام الدهنية ، تابع عزل الأنسجة الدهنية عن اليرقة المتحولة. ضع الأجسام الدهنية المعزولة التي تعبر عن مستشعرات الحنق في غرفة التسجيل.
للحصول على صور للأنسجة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار ، قم بتشغيل نظام الإضاءة في المجهر. ضع حجرة التسجيل التي تحتوي على الحبال العصبية البطنية أو الأجسام الدهنية على مسرح مجهر الفلورسنت. لعرض مضان GCaMP6f ، اضبط الطول الموجي للإثارة على 488 نانومتر.
بالنسبة إلى المستقلبات مثل مستشعرات مقتضبة أو بيرونيك أو ATP أو الجلوكوز ، اضبط الإثارة على 440 نانومتر. الآن قم بتعيين الحصول على الصورة على فترات منتظمة ل GCaMP6f ومستشعر الأيض. ضع هدف الغمر في الماء ، مع التأكد من بقائه مغمورا.
بعد ذلك ، قم بتوصيل غرفة التسجيل بنظام التروية. استخدم مضخة تمعجية منخفضة التدفق لاستخراج السائل من الغرفة والحفاظ على تدفق مستمر يبلغ ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. ضع المحلول الذي يحتوي على أنابيب 25 سم فوق مرحلة المجهر.
قبل أي تحفيز ، احصل على خط أساس مضان مستقر عن طريق السماح لمحلول التسجيل بالتدفق لمدة خمس إلى 10 دقائق. والآن، استبدل محلول السريان بمحلول التحفيز الذي يحتوي على الجلوكوز أو البيروفات أو اللاكتات لمدة خمس دقائق. التقط صورا للحبل العصبي البطني المحفز الذي تعرض ل 80 ميكرومولار بيكروتوكسين لتقييم النشاط العصبي.
تستجيب المستشعرات المقتضبة في كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الحركية لاكتات مليمولار واحد بمعدل مماثل في بداية النبض. ومع ذلك ، تصل الخلايا العصبية الحركية إلى زيادة أعلى على خط الأساس خلال نبضة الخمس دقائق. زادت إشارة مستشعر الجلوكوز بمعدل مماثل في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية عند تعرضها لخمسة مليمولار جلوكوز.
ومع ذلك ، أثناء نبض الجلوكوز ، تزداد الإشارة في الخلايا العصبية أكثر من الخلايا الدبقية. ضرب ناقل Chaski قلل من نقل اللاكتات في الخلايا الدبقية. أدت الزيادات التي يسببها البيكروتوكسين في النشاط العصبي إلى انخفاض مؤقت في مستويات ATP في سوما الخلايا العصبية الحركية.
لوحظ أن المستشعر المقتضب يتم التعبير عنه جيدا في الأجسام الدهنية. شوهدت زيادة مضان مستشعرات الجلوكوز عندما تعرضت الأجسام الدهنية لزيادة تركيز الجلوكوز. أدت زيادة تركيزات اللاكتات والبيروفات إلى زيادة نسبية في مضان مقتضب وبيرونيكي.
