للبدء ، خذ ثقافات Pseudomonas aeruginosa المزروعة لمدة 24 ساعة. ثم اضبط كثافته البصرية على 600 نانومتر إلى 0.2 وقم بعمل تخفيفات مناسبة باستخدام محلول ملحي 0.8٪. باستخدام حلقة سلكية معقمة ، قم بخط الثقافة البكتيرية على لوحة أجار CAS.
احتضان لوحة أجار CAS عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. نقل الثقافة إلى لوحة عيار 96 بئرا وقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. بعد ذلك ، نقل الثقافات إلى أنابيب الطرد المركزي.
الطرد المركزي الثقافة البكتيرية في 4650 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماصة من 100 ميكرولتر من طاف الخلية الخالي من الخلايا ، وإضافته إلى بئر من لوحة 96 بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من صبغة CAS إلى البئر.
غطي اللوحة بورق الألمنيوم قبل الحضانة. بعد الحضانة ، خذ قراءات طيفية عند 630 نانومتر واحسب الكمية الإجمالية ل siderophores كوحدة siderophore في المائة. ماصة 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا في لوحة عيار 96 بئرا.
ثم أضف 100 ميكرولتر من حمض تريس هيدروكلوريك إليها. قم بقياس القراءة الطيفية للمحلول عند 405 نانومتر. لاستخراج البيوشلين ، أولا ، ماصة 100 ملليلتر من الثقافات المزروعة لمدة 48 ساعة من Pseudomonas aeruginosa في أنابيب الطرد المركزي.
أجهزة الطرد المركزي الثقافات في 4650 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من حامض الستريك المولي إلى المادة الطافية. أضف 50 ملليلتر من أسيتات الإيثيل إلى المحلول لاستخراج البيوشيلين.
تصفية المرحلة العضوية مع كبريتات المغنيسيوم من خلال مرشح حقنة. ثم قم بتخزين المرحلة العضوية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أخيرا ، خذ قراءات طيفية ضوئية عند 320 نانومتر.
طورت العزلات السريرية الثلاث والسلالة المرجعية ، PAO1 ، هالة برتقالية صافية عند زراعتها على CAS agar ، مما يدل على إنتاج siderophore. لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين إجمالي إنتاج siderophore لعزل J3 و PAO1. قدمت التحليلات الطيفية لمستخلص البيوفيردين ذروة مؤكدة عند 380 نانومتر.
في حين أن جميع العزلات كانت إيجابية لإنتاج البيوفيردين ، أظهر MR1 و J3 إنتاجا أقل بالنسبة للسلالة المرجعية. تم تأكيد وجود pyochelin من خلال ذروة عند 320 نانومتر. أنتجت جميع العزلات السريرية الثلاثة كميات أكبر بكثير مقارنة ب PAO1.
