نقل وعزل وفحص خلايا هيلا بالضربة القاضية CENP-E

للبدء ، أضف 0.25٪ محلول Trypsin-EDTA إلى خلايا HeLa واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. افصل الخلايا برفق عن طريق ماصة وزرعها في أطباق جديدة بنسبة واحد إلى أربعة لمرور الخلية. لنقل البلازميد إلى خلايا هيلا ، امزج ميكروجراما واحدا من بلازميد PX458 sgRNA المصدق عليه ، مع 50 ميكرولترا من وسط المصل المختزل في أنبوب A.In أنبوب B ، وامزج برفق ميكرولتر من كاشف النقل و 50 ميكرولترا من وسط المصل المختزل واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم ، ادمج المحتويات من الأنابيب A و B واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق أخرى. أضف الخليط إلى الصفيحة المكونة من 12 بئرا واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. في نهاية الحضانة ، استبدل الوسيط بوسط DMEM جديد.

بعد 24 أو 48 ساعة ، قم بتقييم كفاءة النقل عن طريق فحص خلايا HeLa تحت المجهر الفلوري. فصل خلايا هيلا المنقولة بالكامل باستخدام 0.25٪ تربسين EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer أو عداد الخلايا الآلي.

قم بتقسيم الخلايا إلى ثلاث لوحات منفصلة من 96 بئرا لكل مجموعة منقولة باتباع طرق التخفيف التسلسلي. أعد الخلايا إلى حاضنة مرطبة لمدة أسبوع إلى أسبوعين. للفحص القائم على النمط الظاهري والتحقق من CENP-E Knockout ، قم بفصل الخلايا وتوسيعها في 24 بئرا أو 12 بئرا لمدة خمسة إلى سبعة أيام.

افحص الخلايا الطافرة بأقطار مستعمرة أصغر باستخدام مجهر مقلوب مع عدسات موضوعية للتكبير 10 مرات و 20 مرة. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا لاستخراج الحمض النووي من خلال استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي للحيوان العمودي باتباع تعليمات الشركة المصنعة وإعداد تفاعلات البلمرة المتسلسلة. قم بربط الحمض النووي المستهدف في ناقل pMD18-T وفقا لتوجيهات بروتوكولات الشركة المصنعة.

نقل البلازميد المربوط إلى خلايا DH5-Alpha المختصة ، والمضي قدما في الثقافة لاختيار الاستنساخ. لتحديد أنواع CENP-E Knockout ، اعزل الحمض النووي للبلازميد بمساعدة مجموعة استخراج البلازميد باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بإجراء تسلسل سانجر للحمض النووي البلازميد لكل مستعمرة باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية M13.

قم بزرع النوع البري وخلايا HeLa الطافرة CENP-E على غطاء زجاجي 12 ملم ينزلق في صفيحة 24 بئرا. قم بإزالة وسط DMEM الكامل وإصلاح الخلايا باستخدام محلول بارافورمالدهيد 4٪ و PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتلطيخ النوى باستخدام DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

مراقبة الخلايا الطافرة CENP-E والتحقق من صحتها بناء على النمط الظاهري لمحاذاة الكروموسوم باستخدام مجهر مضان. أظهر فحص النمط الظاهري للمستعمرات أن خلايا CENP-E Knockout أظهرت زيادة في اختلال الكروموسوم مقارنة بالمجموعة الضابطة.