Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

لتضمين الخلايا بالبارافين ، اضبط آلة البارافين على 58 درجة مئوية. باستخدام كماشة ، انقل إدخالات الغشاء لتنظيف الآبار من لوحة معقمة من 24 بئرا. أضف 500 ميكرولتر من 37٪ من الفورمالين المخزن مؤقتا و PBS فوق المرشح ، وملليلتر واحد أسفل الفلتر.

أغلق الغطاء واترك اللوحة في غطاء دخان لمدة ساعتين. بمجرد فصل الصفيحة المخصوصة عن الغشاء ، انقل الغشاء المخاطي المعوي إلى دورق يحتوي على 25 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 35٪ ، واحتضانه لمدة 10 دقائق. بعد الجفاف في زيادة تركيزات الإيثانول ، ضع العينات في 50 ملليلتر من الزيلين أو عامل مسح نسيجي لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

بمجرد أن تصبح العينات شفافة ، ضعها في حامل كاسيت الأنسجة المعدنية واغمرها في البارافين السائل داخل آلة ساخنة. بعد 45 دقيقة ، استخدم ميكروتوم لقطع أربعة أقسام ميكرون. ضع القسم المقطوع على الشرائح وجففها في فرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

يتكون نموذج الغشاء المخاطي المكافئ المعوي 3-D المقبول من خلايا Caco-2 التي تشكلت في طبقة أحادية ضيقة ومنتظمة فوق الصفيحة المخصوصة الغنية بالمصفوفة خارج الخلية. تشمل النماذج غير المقبولة تلك التي تظهر نموا مفرطا أو طبقات ظهارية غير منظمة أو تشوها أو عدم تكوين طبقة ظهارية. أدى التأثير الالتهابي لبروتين القمح الذي يحتوي على نسبة عالية من الغلوتين إلى تعطيل الطبقة الأحادية الخلوية وتقليل سمك الطبقة الظهارية مقارنة بالمجموعة الضابطة.

كان محتوى بروتين الأوكلودين أعلى بكثير في المجموعة الضابطة منه في المجموعة المعرضة لبروتين الغلوتين. أظهر تلطيخ CD14 و CD11b للوحيدات U937 أن بروتين القمح الذي يحتوي على نسبة عالية من الغلوتين ينشط الخلايا الوحيدة ، ويؤدي إلى هجرتها وتمايزها إلى البلاعم. في ظل تحدي عديد السكاريد الدهني ، زادت خلايا Caco-2 من إنتاج المخاط وإطلاق علامة الالتهاب midkine.