طلاء المواد العضوية السليمة المشتقة من المريض وإعداد معلمات التصوير لتصوير الخلايا الحية المتعددة

للبدء ، خذ أنبوبا به عضويات مشتقة من المريض أو تعليق PDO في كمية متساوية من مستخلصات الغشاء القاعدي ، أو BME. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ، قم بزرع خمسة قباب ميكرولتر في وسط كل بئر من صفيحة بئر 96 تم تسخينها مسبقا. بعد بذر جميع الآبار ، ضع الغطاء على اللوحة واقلبه برفق.

احتضان الصفيحة المقلوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة للسماح للقباب بالتصلب. اقلب اللوحة بحيث يكون الغطاء متجها لأعلى. ثم احتضان مرة أخرى.

بعد إضافة الأصباغ الفلورية والأدوية إلى اللوحات التي تحتوي على PDOs. ضع اللوحة في الاقتباس خمسة. ابدأ تشغيل برنامج Gen5 وفي نافذة مدير المهام ، حدد الوضع اليدوي للتصوير وانقر فوق التقاط الآن.

في الإعدادات ، حدد الهدف والمرشح وتنسيق الصفيحة الدقيقة ونوع الوعاء ، وحدد استخدام الغطاء واستخدم سرعة حاملة أبطأ وانقر فوق موافق. ثم اختر بئر الاهتمام. حدد قناة برايتفيلد ، وانقر فوق تعريض تلقائي واضبط الإعدادات كما هو مطلوب.

بجوار إعداد مكدس Z، قم بتوسيع علامة تبويب وضع التصوير، وحدد مكدس Z، واضبط التركيز باستخدام أسهم ضبط المقرر الدراسي حتى تخرج جميع PDOs عن التركيز. قم بإنشاء هذه النقطة على أنها الجزء السفلي من مكدس Z وكرر في الاتجاه المعاكس لتعيين الجزء العلوي. بعد ذلك ، قم بإعداد قنوات الفلورسنت عن طريق فتح خطوة تحرير التصوير.

ضمن القنوات ، حدد العدد المطلوب من القنوات ، وقم بتعيين قناة واحدة للحقل الساطع وقنوات إضافية لكل قناة فلورسنت. أغلق النافذة بالنقر فوق موافق ، وقم بتغيير القائمة المنسدلة إلى GFP لتعيين التعرض لقناة الفلورسنت الأولى ، وانقر فوق تعريض تلقائي واضبط إعدادات التعرض ضمن علامة تبويب التعرض لتقليل إشارة الخلفية. لنسخ إعدادات التعريض الضوئي إلى علامة تبويب وضع الصورة، انقر فوق أيقونة النسخ ثم انقر فوق خطوة تحرير التصوير لفتح نافذة جديدة.

في قناة GFP، انقر أيقونة الحافظة في خط التعريض لإضافة إعدادات للإضاءة، وقت التكامل، وكسب الكاميرا إلى القناة. انقر الآن على أيقونة الكاميرا واختر المعالجة المسبقة للصور ضمن خطوة إضافة معالجة. في علامة التبويب برايتفيلد ، قم بإلغاء تحديد خيار تطبيق المعالجة المسبقة للصورة.

لكل علامة تبويب قناة فلورسنت ، تأكد من التحقق من تطبيق المعالجة المسبقة للصور. قم بإلغاء التحديد، واستخدم نفس خيارات القناة الأولى، ثم انقر فوق موافق لإغلاق النافذة. انقر الآن على Z projection ضمن خطوة إضافة المعالجة ، واضبط نطاق الشريحة إذا لزم الأمر ، وأغلق النافذة بالنقر فوق موافق.

لإعداد بروتوكول التصوير الحركي، في شريط الأدوات انقر فوق مجموعة الصور، ومن القائمة المنسدلة، اختر إنشاء تجربة من مجموعة الصور هذه. انقر فوق الخيارات الموجودة أسفل العنوان الآخر وحدد مربع الإجراء الحركي المتقطع. ضمن الوقت الإجمالي المقدر، أدخل وقت تشغيل التجربة.

أغلق النافذة بالنقر فوق موافق. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين تخطيط اللوحة وتدرج درجة الحرارة في هذا الوقت. تحقق من صحة خطوات تقليل البيانات بالنقر فوق النوافذ.

ثم انتقل إلى ملف وانقر فوق حفظ البروتوكول كما في شريط الأدوات. حدد موقع حفظ. أدخل اسم ملف وانقر فوق حفظ.

لبدء التصوير الحركي ، قم بتحميل البروتوكول في برنامج جدولة bio spa عند الطلب واختر فتحة متاحة. في علامة التبويب معلومات الإجراء، حدد المستخدم من القائمة. بجوار فتحة البروتوكول ، انقر فوق تحديد واختر إضافة إدخال جديد.

الآن انقر فوق تحديد بجوار فتحة البروتوكول. انقر فوق فتح للتنقل واستيراد البروتوكول إلى برنامج الجدولة. أدخل وقت التصوير المطلوب للوحة وانقر فوق موافق لإغلاق النافذة.

ضمن الفاصل الزمني ، أدخل التردد المطلوب للتصوير ، وحدد الجدول الزمني أو اللوحة أو الوعاء لبدء تسلسل التحقق من صحة اللوحة ، انقر فوق نعم لقبول هذا الجدول.