للبدء ، استخدم بادئات محددة 515f و 806r لتضخيم منطقة V4 شديدة التغير لجين 16S rNA. إجراء PCR باستخدام الشروط المحددة. بعد ذلك ، أضف 3.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتسلسل و 1.5 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى الأنبوب.
بعد خلط العينة وغزلها ، قم بإعداد تفاعل thermocycler. الآن ، أضف خليط ربط المحول في الأنبوب واحتضانه عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في دورة حرارية. أضف 1.5 ميكرولتر من إنزيم كاشف التمديد الخاص باليوراسيل إلى مزيج الربط ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
الآن ، أضف 43.5 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي إلى الحمض النووي لربط المحول واخلطه 20 مرة. بعد خمس دقائق ، ضع الأنبوب في رف مغناطيسي لمدة خمس إلى 10 دقائق لفصل الخرزة وتخلص من المادة الطافية. اغسل الحبيبات ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ وجفف الخرز لمدة 30 ثانية.
لإذابة الخرزات في الحبيبات ، أضف 8.5 ميكرولتر من 10 مليمول تريس حمض الهيدروكلوريك في الأنبوب واحتضانها لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي وقم بإزالة 7.5 ميكرولتر من الحمض النووي المستعصي باعتباره مادة طافية في أنبوب جديد. أضف كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الأنبوب المحتوي على الحمض النووي المربوط لإعداد تفاعل 25 ميكرولتر.
لتنظيف الحمض النووي المضخم ، أضف 22.5 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي في الأنبوب واخلطه 20 مرة. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة 50 ميكرولترا من المادة الطافية واغسل الخرزات ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪. إعادة تعليق ال حبات بنية داكنة في 16 ميكرولتر من الماء وتخلط 20 مرة.
ضع الأنبوب في الرف المغناطيسي لمدة 30 إلى 60 ثانية وانقل 15 ميكرولترا إلى أنبوب جديد. امزج 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت ، وميكرولتر واحد من الصبغة ، وميكرولتر من عينة مكتبة الحمض النووي واقرأ تركيز الحمض النووي على مقياس الفلور. بعد تخفيف الحمض النووي إلى اثنين نانولار ، قم بتحميل 27 إلى 30 ميكرولترا من خلية التدفق وضعها في جهاز التسلسل.
احفظ ملفات FASTQ التي تم الحصول عليها من جهاز التسلسل. انقر لفتح ملف جدول بيانات وإنشاء ملف تعيين أو بيانات وصفية. افتح موقع Nephele على الويب ، وقم بتحميل ملفات FASTQ ، واقرأ QC End QIIME2 ، وقم بإجراء التصفية والتشذيب.
بعد ذلك ، باستخدام DADA2 ، قم بتنفيذ قراءات النهاية المزدوجة غير المتعددة ، واستبدال المرشح ، وأخطاء الوهم ، والدمج. استخدم مصنف Naive Bayes المدرب على وحدة التصنيف التشغيلي Silva الإصدار 132 99٪ ، أو قاعدة بيانات OTU ، لأداء التعيين التصنيفي البكتيري عند تشابه 97٪. افتح موقع MicrobiomeDB على الويب.
انقر لتحميل الملفات ، وإنشاء تنوع OTU alpha ، وتنوع بيتا ، والوفرة النسبية ، ومنحنيات التخلخل. أخيرا ، افتح جدول بيانات وانقل البيانات لإنشاء خرائط حرارية ومخططات Venn وحجم تأثير التحليل التمييزي الخطي. أظهرت خريطة حرارية تستند إلى الوفرة النسبية للبكتيريا في مراحل مختلفة من صناعة النبيذ هيمنة الشعب مثل Proteobacteria و Actinobacteriota و Firmicutes و Bacteroidota و Fusobacteriota.
على مستوى الجنس ، تم تحديد أجناس مهمة مثل Enterobacteriaceae و Lactobacillaceae. كشف تحليل مخطط Venn عن 15 وحدة OTU فريدة مشتركة من العنب إلى النبيذ النهائي. أشارت نتائج تسلسل amplicon بناء على منطقة متغير V4 أيضا إلى تنوع ألفا في تحليل التنوع في اثنين من traminette R و L.Beta أظهر تحولا في البكتيريا أثناء التخمير ، لكن التركيب البكتيري في النبيذ النهائي كان مشابها لذلك في المراحل المضافة والخميرة المضافة.
