للبدء ، ضع بذور براسيكا نابوس DH12075 في أنابيب صغيرة. لتقليل البذور ، أضف الماء و 0.1٪ منظف إلى الأنبوب الصغير ، ورجه لمدة 60 ثانية. الآن شطف البذور بالماء متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول ، كل منها لمدة 60 ثانية.
بعد ذلك ، ضع البذور في محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ ورجها لمدة 20 دقيقة. بعد إزالة المبيض ، اغسل البذور أربع مرات بالماء المعقم لمدة 60 ثانية لكل منها. ضع البذور على طبق بتري يحتوي على وسط إنبات البذور.
قم بتقسيم البذور إلى طبقات باردة عند أربع درجات مئوية طوال الليل قبل نقل الطبق إلى غرفة الزراعة. بعد خمسة أيام ، انقل الشتلات إلى صندوق زراعة نباتي يحتوي على وسط نمو النبات. تلقيح Ti أقل agrobacterium tumefaciens C58C1 يحمل بلازميد PRIA 4B المشعر الذي يحفز الجذر في خمسة ملليلتر من وسط LB.
قم بتنمية الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.9 إلى واحد. نقل اللقاح البكتيري إلى المحقنة. باستخدام إبرة قياس 26 مثبتة على المحقنة ، قم بثقب hypocotyl لشتلة عمرها 18 يوما على ارتفاع حوالي سنتيمتر واحد فوق وسط النمو.
حقن ما يقرب من 50 ميكرولتر من اللقاح في الجرح وخدش الأنسجة على سطح hypocotyl. أعد النبات إلى غرفة الزراعة عند 21 درجة مئوية لمدة أسبوعين إلى أربعة أسابيع. بعد ذلك ، قم بقطع الكالس بجذور مشعرة ظهرت من hypocotyl.
ضع الكالس ذو الجذور المشعرة على طبق بتري يحتوي على وسط نمو جذور الشعر والمضادات الحيوية لقمع نمو البكتيريا الزراعية. أغلق الطبق بشريط منفذ للغاز قبل احتضانه عند 24 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اعزل الجذور المشعرة عن الكالس ، وانقل الجذور الفردية إلى وسط نمو جذر الشعر.
بدلا من ذلك ، لتوليد نبات مركب يتكون من براعم من النوع البري وجذور شعر معدلة وراثيا ، قم بإزالة الجذور الأصلية للنبات. ثم انقل النبات ذي الجذور المشعرة الناشئة إلى صندوق استزراع يحتوي على وسط نمو النبات ومضادات حيوية لقمع نمو البكتيريا الزراعية.
