سلالات الشيغيلا ثلاثية الخطوط على ألواح أجار تحتوي على صبغة الكونغو الحمراء لضمان أن المستعمرات خبيثة ولمنع استخدام المستعمرات غير الخبيثة في فحوصات العدوى. للبدء ، خذ ثقافات الشيغيلا المزروعة بين عشية وضحاها ودوامة لهم. أضف 100 ميكرولتر من المستنبتة إلى خمسة ملليلتر من TSB الطازج في أنبوب الاستزراع.
احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية تبلغ 0.7 عند 600 نانومتر. نقل 2 مرات 10 إلى 8 وحدات تشكيل مستعمرة من الشيغيلة المستزرعة الفرعية إلى 2 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 17،000 غرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
نضح الطاف. أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني دافئ ، وأعد تعليق الحبيبات جيدا. بعد الطرد المركزي للخلية مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من DMEM الدافئ ، ودوامة تعليق الخلية.
ثم أضف ملليلتر واحد من الشيغيلة المعاد تعليقها وملليلتر واحد من DMEM إلى كل بئر من الطبقات الظهارية القولونية HT29 في ست لوحات بئر. لضمان التلامس البكتيري مع خلايا HT29 ، قم بطرد مركزي لألواح الآبار الستة عند 2،000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية. احتضان ستة ألواح بئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة.
لتحديد عيار العدوى البكتيرية ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية عشرة أضعاف لخلايا الشيغيلا المعلقة في برنامج تلفزيوني. لوحة 100 ميكرولتر من 1 في 10 إلى 5 و 1 مرة 10 إلى 6 التخفيفات على لوحات الكونغو الحمراء مع TSB ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، نضح الوسائط من كل بئر.
أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر ، واغسله بلطف. ثم أضف ملليلتر من DMEM الدافئ مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين ، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. اغسل خلايا HT29 المصابة ثلاث مرات بمليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
أضف ملليلتر من DMEM الدافئ مع الجنتاميسين إلى كل بئر ، واحتضانه لمدة تصل إلى 24 ساعة للتكاثر داخل الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. أضف ملليلتر واحد من PBS مع 1٪ Triton X-100 إلى كل بئر لخلايا HT29 المحللة.
ثم باستخدام مكشطة الخلية أو طرف ماصة عازمة ، اكشط الخلايا المحللة من قيعان البئر ، وانقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر. دوامة كل أنبوب لمدة 30 ثانية على الأقل لإزاحة الشيغيلة من الخلايا حقيقية النواة المحللة. إعداد عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية من المحللين و PBS.
صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية على صفائح الكونغو الحمراء مع TSB ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
