للبدء ، قم بإذابة ملليغرام من PEG متعدد التكافؤ مع مجموعة ماليميد التفاعلية ، ومليلتر واحد من 100 مليمول فوسفات عازل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. أضف اتحادات ببتيد الحمض النووي المنتهي بالسيستين إلى المحلول.
استخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإزالة المواد غير المقترنة. قم بتشغيل العينات في PBS. مراقبة امتصاص للكشف عن الحمض النووي والببتيدات.
ضع العينة في أنابيب مرشح الطرد المركزي وقم بتركيز المستشعرات النانوية المركبة عن طريق الطرد المركزي وفقا للسرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. استخدم صفيحة 96 بئرا كقاعدة لغرفة الإسكان المخصصة. لجمع البول لقياسات خط الأساس ، ضع الماوس أولا في غرفة السكن.
اضغط برفق على مثانة الفأر المقيدة لطرد أي بول متبقي على الطبق. ماصة البول الذي تم جمعه في أنبوب 1.5 ملليلتر. تحضير 200 ميكرولتر من محلول حقن المستشعر النانوي في برنامج تلفزيوني معقم.
حقن 200 ميكرولتر من المحلول عن طريق الوريد في كل ماوس. بعد ساعة واحدة من الحقن ، اجمع عينات البول من الفئران الضابطة والتجريبية. للكشف عن كريسبر القائم على التألق للرموز الشريطية للحمض النووي ، قم بطرد عينات البول عند 800 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
الآن اجمع كواشف كريسبر ، ثم أضف إنزيم Cas12a قبل سحب خليط التفاعل برفق لأعلى ولأسفل. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتشغيل رد فعل المراسل باستخدام خليط الحمض النووي للمراسل القائم على FRET.
أضف الخليط إلى طبق من 384 بئرا وقم بقياس التألق على الفور عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة ثلاث ساعات لمراقبة حركية الانقسام. لإجراء الكشف الورقي عن كريسبر ، قم بتشغيل رد فعل مراسل بديل بعد حضانة تفاعل كريسبر باستخدام مراسل الحمض النووي المسمى FAM-Biotin. بعد دمج الكواشف في صفيحة 96 بئرا ، قم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، ثم ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
أضف الآن 80 ميكرولترا من PBS إلى بئر جديد من صفيحة 96 بئرا. ماصة 20 ميكرولتر من خليط تفاعل المراسل في هذا البئر. ضع شريط ورق التدفق الجانبي على كل بئر ، وانتظر حتى يصل السائل إلى أعلى الشريط.
أظهر الحمض النووي أحادي الشريط المعدل كيميائيا تنشيط Cas12a بالنسبة إلى الحمض النووي المزدوج غير المعدل الذي تقطعت به السبل والحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. أظهرت جزيئات الحمض النووي المعدلة في البول غير المعالج قراءات لونية على شرائط ورق التدفق الجانبي. أشار نطاق العينة الرئيسي إلى إطلاق FAM القابل للكشف من خلال انشقاق المراسل الناجم عن الحمض النووي البولي.
