للبدء ، ضع قوالب microwell PDMS ومحلول الشطف المضاد للالتصاق وارتداء المختبر الضروري في غطاء زراعة الأنسجة. لغسل قوالب microwell PDMS ، استخدم ماصة 1،000 ميكرولتر لإضافة 300 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى كل بئر. ثم أجهزة الطرد المركزي لوحة ، 1،620 غرام لمدة ثلاث دقائق.
استخدم مضخة تفريغ وماصة باستور لشفط المحلول. بعد ذلك ، ضع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية عند التركيز المطلوب في الآبار الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي للوحة عند 1،620 جم لمدة ثلاث دقائق. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة للسماح بتكوين كروي.
لحصاد الأجسام الكروية ، باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، أضف بقوة 500 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر. ماصة الوسط المضاف لأعلى ولأسفل في كل ربع ثلاث إلى أربع مرات لإزاحة السبيرويدات. ثم استخدم الماصة لشفط الوسط الذي يحتوي على الكرويات برفق في أنبوب طرد مركزي دقيق.
نقل 50 ميكرولتر من تعليق الستيرويد في أنبوب الطرد المركزي. ثم أضف بالتتابع 4-Arm PEG acrylate و PEG dithiol فيه. امزج المحلول الناتج عن طريق سحبه لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات.
لإنتاج 100 ميكرولتر من محلول سلائف PEG hydrogel بوزن 10٪ من حيث الحجم ، ماصة 20 ميكرولتر من محلول سلائف الهلام بين شريحتين زجاجيتين مبطنة بالبارافيلم مفصولتين بفواصل سيليكون ملليمتر واحد واحتضان الشرائح بمحلول سلائف جل للسماح بالهلام. بمجرد اكتمال هلام الهيدروجيل ، باستخدام ملعقة ، قشر المواد الهلامية برفق من الشرائح الزجاجية المنفصلة. ضع هلاما واحدا لكل بئر في طبق مكون من 24 بئرا ، مع التأكد من أن السطح الذي يحتوي على الأجسام الكروية متجها لأعلى.
أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر لغمر الهيدروجيل تماما. ضع اللوحة متعددة الآبار في حاضنة مرطبة لزراعة الخلايا. أدت التقنية الموصوفة باستخدام قوالب microwell إلى تكوين كرويات ذات أشكال كروية وتعدد تشتت يتم التحكم فيه بإحكام.
بالنسبة للكرويات التي تحتوي على 3،300 خلية لكل ميكروويل ، كان متوسط حجم الكرة حوالي 250 ميكرون وكانت الدائرية أكبر من 0.8 ، مع الأخذ في الاعتبار قيمة 1 ككرة مثالية. كانت أقطار الكروية تعتمد على حجم البئر الصغير وعدد الخلايا لكل ميكروويل.
