للبدء ، خذ عظام الفخذ والساق والحوض وعظم العضد المعزولة من الفأر. استخدم مشرطا لقطع صفائح نمو العظام الطويلة ، وإزالة المشاش. ضعه في طبق 10 سم مع متوسط M199 بالإضافة إلى 2٪ FBS على الثلج.
بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 28 وحقنة سعة 10 ملليلتر مملوءة بمتوسط M199 بالإضافة إلى 2٪ FBS لغسل النخاع في أنبوب سعة 15 ملليلتر على الجليد. ضع العظم المتدفق في الطبق مع المشاش. اترك الأنبوب سعة 15 ملليلتر في وضع مستقيم على الثلج حتى يستقر النخاع.
ثم قم بإزالة وسيط M199 بالإضافة إلى 2٪ FBS أضف أربعة ملليلتر من كوكتيل تفكك B&M إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر واحتضانه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اجمع المادة الطافية وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب بارد سعة 50 ملليلتر. أضف ملليلتر من كوكتيل تفكك B &M الطازج إلى حبيبات نخاع العظم المتبقية وأعدها إلى حمام مائي.
باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، ماصة بقوة أي قطع نخاع عظمي متبقية. اجمع كل تعليق الخلية في نفس الأنبوب كما كان من قبل. أضف 20 ملليلتر من وسط M199 مع 0.5٪ BSA ، و 2 مليمولار EDTA إلى تعليق الخلية.
بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS مع 0.5٪ BSA والأجسام المضادة للبيوتين. احتضان على شاكر مداري لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
المقبل ، دوامة الخرز المغناطيسي تماما. أضف 25 ميكرولترا من الخرز إلى الأنبوب واحتضانه مرة أخرى على شاكر المداري. ضع الأنبوب في مغناطيس مطابق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق واجمع المادة الطافية في أنبوب جديد.
قسم العظام إلى قطع أصغر في الطبق الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات باستخدام طرف الغطاء المسطح لأنبوب سعة 50 ملليلتر. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لعزل شظايا العظام. قطع شظايا العظام في مصفاة الخلية بالمقص.
ضع المرشح مع شظايا العظام على أنبوب سعة 50 ملليلتر وافتح المرشح بالمشرط. باستخدام الملقط ، انقل جزء العظم إلى خمسة ملليلتر من مزيج تفكك الفئران B&M. ثم ضع الأنبوب أفقيا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
بعد الهضم ، أضف 25 ملليلتر من وسط M199 مع 0.5٪ BSA و 2 مليمولار EDTA. قم بتصفية المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا اللحمية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب بارد سعة 50 ملليلتر.
