ويؤيد هذا العمل من خلال تقديم المساعدة لإنتاج العلاجات الخلوية (المعاهد الوطنية للصحة العقد ، NHLBI (HB - 10 - 03) HHSN26820100000C) (CMR) ، ومراكز متخصصة لعلاج خلية مقرها المنح NIH - U54 HL081007 NHLBI 1 (CMR) ، وهو ASBMT جائزة الباحث الشاب (UG وJV) ، وزميل جمعية سرطان الدم والغدد اللمفاوية الخاصة في جائزة البحوث السريرية (UG) ، والباحث العلمي جائزة ايمي Manasevit Strelzer (AML).

1. DC nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الوحيدات المستمدة من البلدان النامية ، والتي تم الالتزام به المخصب البلاستيك ، ومثقف لمدة 5 أيام باستخدام خلية Genix تستكمل مع وسائل الإعلام IL4 (1000U/ml) ، GMCSF (800IU/ml) ونضجت لمزيد من 24hrs باستخدام السيتوكينات نضوج العاصمة IL4 (1000U / مل) ، GMCSF (800IU/ml) ، IL6100ng/ml ، TNF - α 10ng/ml ، 10ng/ml IL1 - β وPGE2 (1μg/ml) 1 ، عن طريق إعادة تعليق لطيف مع ماصة نقل 3ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد البلدان النامية قادرة على البقاء به التريبان الأزرق ، ونقل إلى أنابيب 3X مع 15ml مما لا يقل عن 6 و 0.5x10 لا يزيد على 6 خلايا 2x10 / أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي للبلدان النامية 10mins @ 200G. خلال هذا الوقت قبل وسائل الاعلام الحارة خلية Genix تستكمل مع السيتوكينات نضوج العاصمة (وسائل الإعلام نضوج DC) -- 2ml/well في ثلاثة آبار لزراعة الأنسجة 12 يعامل بشكل جيد لوحة في 37 ° / C 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء من الخلايا الغزل ، ونضح وطاف وإضافة البلازميدات الحمض النووي ذات الصلة في كل من الأنابيب في التركيز النهائي من الحمض النووي 5μg / أنبوب. في هذه الحالة إضافة ترميز البلازميد IE1 pp65 - إلى أنبوب رقم 1 ، Hexon - بينتون إلى أنبوب رقم 2 ، وEBNA1 - LMP2 - BZLF1 إلى أنبوب # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend البلدان النامية والحمض النووي مع 100μl حل nucloefection Amaxa ، تخلط جيدا ونقل إلى cuvettes nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cuvettes مكان في nucleofector 4D ، واختيار البرنامج CB150 (Amaxa / Lonza) ، ثم اضغط على بدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج مباشرة بعد إضافة nucleofection 500μl 2ml من قبل وسائل الإعلام تحسنت الخلية Genix نضوج العاصمة لكفيت ، بلطف صعودا ونزولا pipetting 2-3 مرات ، ونقل nucleofected البلدان النامية إلى لوحة 12 - المعدة إعدادا جيدا المتبقية التي تحتوي على 1.5 مل من prewarmed وسائل الاعلام العاصمة النضج. نقل إلى 37 لمزيد من 18hrs - 12 C / 5 ٪ CO 2 حاضنة درجة. </li></ol> 2. تي الخلية التحفيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد وعدد البلدان النامية nucleofected ، وأشرق في 30Gy. يغسل مرة واحدة مع 10ML CTL المتوسطة (45 ٪ RPMI ، الزيارات EHAA 45 ٪ ، 10 ٪ FBS ، 2mm وGlutamax) وresuspend @ 3 × 10 5 مل من البلدان النامية في وسائل الاعلام CTL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع ما لا يقل عن 7.5x10 5 (2.5ml) وبحد أقصى 15x10 5 (5ml) من البلدان النامية التي تحتوي على كل من البلازميدات ونقل البلدان النامية المجمعة للجهاز G - ركس والتي سوف ثم يوضع في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الرد إما استخدام خلايا مجمدة PBMCs سابقا أو غير ملتصقة الخلايا وحيدة النواة التي تبقى بعد اختيار العاصمة (التقيد أو التحديد CD14). أذاب الخلايا ، ونقل إلى مستنبت prewarmed ، ويغسل مرة واحدة مع وسائل الاعلام CTL. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام CTL ، عد الخلايا وتقديمهم للتركيز الخلايا 6 2x10 لكل مليلتر. تأخذ 15x10 6 خلايا أو 7.5ml والملحق مع 30000U IL4 (1000U/ml -- اضرب النهائي) و300ng IL7 (10ng/ml -- اضرب النهائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 7.5ml من PBMC (15x10 6 خلايا) إلى G - ريكس وأعلى حتى من مفاعل حيوي مع وسائل الاعلام CTL إلى إجمالي حجم 30ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة G - ركس ل6-7 أيام في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 حاضنة مرطب. </li></ol> 3. تي خلية التوسع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 07/06 ، 10ML نضح من وسائل الإعلام ، ثم خليط الخلايا في 20ml المتبقية من وسائل الاعلام مع ماصة 10ML والعد باستخدام خلايا قابلة للحياة التريبان الأزرق. إذا كان هناك &lt;50x10 6 تجديد مع وسائل الاعلام الطازج + السيتوكينات. إذا كان هناك&gt; 50x10 6 خلايا إزالة 10ML التعليق الخلية ، ونقل إلى ريكس - G الجديد ، ومن ثم خدمة كل من G - Rexs مع وسائل الاعلام CTL + السيتوكينات الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة ل4-6 أيام إضافية. مرة واحدة وقد تم توسيع خلايا كافية ، وأداء الخصائص المظهرية والوظيفية للفائض CTL وcryopreserve لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 4. ممثل النتائج : ويرد التخطيطي لدينا وافقت عليها الهيئة multivirus محددة عملية توليد CTL في الشكل 1. وعلى النقيض من بروتوكولات الاتفاقية CTL multivirus التي تستخدم adenovectors وEBV LCL - الفيروس لتحفيز التفاعل خلايا تي 2 لدينا استبدال المواد المعدية فيروس البلازميدات مع الحمض النووي تكود المستضدات المتعددة المستمدة من كل من الفيروسات 3. لتحفيز trivirus CTL مصممة لدينا ثلاثة multicistronic البلازميدات ترميز Hexon وبينتون واتش ، وIE1 pp65 من CMV ، وEBNA1 ، LMP2 ، وBZLF1 من EBV. وقد تم اختيار هذه المستضدات على أساس نتائج مشجعة السريرية لمنطقتنا والمجموعات الأخرى التي تبين أن الخلايا T - الموجهة ضد أدفانسد hexon وبينتون 2،4-6 ، وCMV - 1E1 وCMV - pp65 وقائية في الجسم الحي 7. لEBV ، EBNA1 هو سائد مناعيا CD4 + T مستضد الخلية المستهدفة التي أعرب عنها في جميع الأورام الخبيثة المرتبطة EBV في الخلايا الطبيعية وباء EBV المصابين 8،9 ، LMP2 يولد مناعة عبر أنواع HLA متعددة ، وأعرب عن معظم الأورام الخبيثة في EBV ، في حين أن 10،11 BZLF1 بترميز آن ، على الفور في وقت مبكر سائد مناعيا مستضد دورة lytic التي تحفز كلا CD4 + CD8 + وخلايا تي من معظم الأفراد والمهم المحتمل للتعاونntrol الخلايا تكرار الفيروس 12. لمزيد من تحسين طرق التصنيع لدينا تعاونا مع تقنية الطبيعة الذي ولدت minimalized ، خالية من المضادات الحيوية (FDA المتوافقة) البلازميدات لتحفيز CTL 13،14. باستخدام هذه الاستراتيجية أن نحقق الكفاءة باستمرار nucleofection من 35 ٪&gt; عالية مع المحافظة على سلامة الخلية (لا تظهر البيانات) 3. الشكل 2 يبين أن تواتر الفيروس الخلايا T محددة ردا على الحمض النووي البلازميدات الأمثل مقاسا ELIspot IFNγ ، كان أكبر من ردا على التعبير البلازميدات pShuttle التقليدية المستندة إلى التعبير عن مستضدات نفس (ن = 8 اتش ، ن = 4 CMV ، و n = 2 EBV). وكان PBMC هامة لتحفيز الخلايا التائية قوية كما هو مبين في الشكل رقم 3 حيث نسبة 01:50 المنتجة دون المستوى الأمثل تفعيل مقارنة 01:20 S : النسبة المثلى من العاصمة R نسبة (ن = 2 المانحين). إنتاج أعداد كافية CTL مع خصوصية المستضد واسع هو شرط مسبق لالفعالية السريرية ضد جميع الفيروسات الثلاثة. ويتحقق ذلك من خلال ثقافة CTL في G - ريكس ، الذي يدعم التوسع متفوقة مقارنة مع الخلايا التائية 24 لوحات جيدة التقليدية (الشكل 4A) 15 ، في حين أن إضافة IL4 وIL7 إلى زيادات الثقافات ذخيرة والنوعية كما هو مبين في الشكل 4B حيث تردد الخلايا التائية المتفاعلة ضد A2 - HLA - CMV pp65 - مشتقة resticted قيمت NLV الببتيد في الثقافات ولدت في وجود أو غياب IL4 و / أو 16،17 IL7. لتقييم قدرة النمط الظاهري والوظيفية للخلايا وسعنا لتحليل تدفق cytometric ، جواني خلوى ELIspot تلطيخ / IFNγ ، وإطلاق سراح 51 المقايسات الكروم على المنتج النهائي لحفظ البرودة / التسريب. عادة الخلايا المولدة والنسائل المتعددة التي يبلغ عدد سكانها خليط من CD4 + و CD8 + الخلايا التائية مع خصوصية مستضد اكتشافها في كل من المقصورات الخلايا التائية. وCTL قادرون على التعبير عن قتل مستضد الفيروسية الخلايا المستهدفة ولكن ليس الفيروس السلبية جزئيا HLA الأهداف المتطابقة ، مشيرا الى انه لا ينبغي لها أن تحفز الطعم ضد المضيف المرض (GvHD) في الجسم الحي (الشكل 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. rCTL ​​بروتوكول جيل. الأولى ، هي nucleofected البلدان النامية مع البلازميدات مستضد الفيروسية ترميز ثم يخلط مع ذاتي في PBMCs على البحث : S 10 أو 20:01. يتم توسيع الخلايا في G - ركس لمدة 10-14 يوما في وجود IL4 IL7 ، ثم حصادها ، محسوبة ، واختبارها من أجل الهوية والوظيفة والعقم ، وcryopreserved ثم للاستخدام السريري. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. البلازميدات الحمض النووي محسن العلوي حمل تفعيل الخلايا التائية في المختبر. وكانت البلدان النامية nucleofected مع محسن وادارة الاغذية والعقاقير المتوافقة Hexon ترميز البلازميدات وبينتون (إيج) ، وIE1 pp65 (CMV) ، وEBNA1 ، LMP2 ، وBZLF1 (EBV) أو البلازميدات pShuttle التقليدية ترميز المستضدات نفسها. وقد استخدمت لتحفيز هذه الخلايا التائية والتي تم تحليل خصوصية ELIspot IFNγ 10 يوما بعد التحفيز. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3 العاصمة الأمثل : نسب الخلايا التائية لتفعيل CTL. وكانت البلدان النامية في الفترة من 2 nucleofected مع جميع الجهات المانحة البلازميدات three الوجه الأمثل ، واستخدمت بعد ذلك لتحفيز PBMCs ذاتي في 1:20 أو 1:50 العاصمة : نسبة PBMC. وجرى تقييم تواتر تنشيط خلايا تي في يوم 10 من ELIspot IFNγ. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. T التوسع في الخلية G - ريكس باستخدام السيتوكينات تعزيز. لوحة ويظهر الجهاز G - ريكس فضلا عن ظهور CTL على الغاز نفاذية الغشاء وتقييمها من خلال الفحص المجهري. ويرد أيضا مقارنة بين الخلية التي تحققت في الانتاج وزراعة الأنسجة لوحات الاتفاقية معاملة مقابل G - ريكس. لوحة باء يبين تواتر CTL مخموس CMV الإيجابية التي تحققت في الثقافات الموسعة في حضور أي خلوى ، IL4 وحده ، وحده ، وIL7 IL4 IL7 +. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> الشكل 5. النمط الظاهري ووظيفة CTL الموسعة. لوحة ويظهر المثال ممثل النمط الظاهري للCTL multivirus الموسعة ، التي النسائل المتعددة مع خليط من CD4 + (45 ٪ -- مساعد) وCD8 + (42 ٪ -- السامة للخلايا) تي الخلايا ، والتي غالبية (95 ٪) أعربوا عن ذاكرة علامة CD45RO + / CD62L +. وحة باء تبين أن هذه الخلايا هي محددة لمستضدات جميع تحفيز وpolyfunctional النحو الذي تقدره تلطيخ خلوى الخلايا للكشف عن إنتاج IFNΓ وTNFα بعد التحفيز مستضد جيم لوحة يظهر أن CTL توسيع وظيفية وفقا للقياس بواسطة مقايسة 51 ساعة معتمدة. واستخدمت LCL ذاتي ، إما وحدها أو مع transduced متجه فارغة أو متجه الفيروسة الغدانية معربا عن CMV - pp65 والقطرانيحصل. وجرى تقييم Alloreactivity باستخدام خيفي الانفجارات PHA كهدف.

<ol>
	<li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function:+a+cautionary+tale.">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li><li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals.">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li><li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host.">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy.">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation.">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li><li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells.">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li><li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4(+)+T-helper+1+responses.">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li><li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBNA1-specific+CD4++T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function.">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li><li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma.">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li><li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans:+lessons+from+Epstein-Barr+virus.">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li><li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response.">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li><li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system.">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li><li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pDNAVACCultra+vector+family:+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids.">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li><li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+(G-Rex.">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , (2009).</li><li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li><li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes.">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li><li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation.">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li><li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+cytomegalovirus+(CMV)-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy.">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li><li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li></ol>

F. خوان فيرا هو مستشار لصناعة ولف ويلسون. الكتاب الآخرين ليس لديهم الافصاحات ذات الصلة.

العدوى الفيروسية لحساب معدلات الاعتلال والوفيات كبيرة في المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة بسبب المرض أو علاجه. بعد HSCT ، على سبيل المثال ، من المعروف جيدا الالتهابات التي تسببها herpesviruses الثابتة مثل وEBV CMV ، فضلا عن الفيروسات مثل فيروس الجهاز التنفسي المخلوي التنفسي (RSV) ، في حين أن أهمية الالتهابات التي تسببها أدفانسد ، BK الفيروس ، وحقوق الإنسان هربس (HHV) وقد تم مؤخرا -6 أكثر تقدير. في حين أن وكلاء الدوائية والعلاج القياسية لبعض الالتهابات ، لديهم السميات كبيرة ، وتوليد البدائل المقاومة ، وغير فعالة في كثير من الأحيان. في المقابل ، أثبتت خلايا تي فيروس محددة مستمدة من المتبرعين بالخلايا الجذعية آمنة وفعالة للوقاية والعلاج من عدوى فيروسية أو مرض في زرع الخلايا الجذعية مكون الدم (HSCT) 2،5،6،18-21 الإعداد. ومع ذلك ، هو في نهاية المطاف محدودة الأوسع تنفيذ المناعي الخلايا التائية من التعقيد والتكلفة والوقت اللازم لإنتاج CTL. وينبغي لنا الرواية ومقاربة سريعة لتوليد multivirus CTL ، وصفت في المخطوطة الحالية ، زيادة كبيرة في جدوى العلاج بالخلايا السامة للخلايا T للأمراض الفيروسية ، وتمكين استراتيجية لتصبح في مستوى من الرعاية للمضيف المناعة. استخدام البلدان النامية وناقلات الجنود المدرعة nucleofected البلازميد يتيح العرض مستضد على كلا الصف الأول والثاني MHC دون منافسة من ناقلات فيروسية أو مولدات المضادات الفيروسية في الواقع من عدة يجري التعبير عنه داخل خلية واحدة منذ تستخدم مجموعات سكانية مختلفة DC لكل 3 البلازميد. استخدام IL - 07/04 يزيد بقاء الخلايا التائية والانتشار ، والتي تساعد في المقابل زيادة وتيرة وذخيرة من الاستجابة محددة مستضد الخلايا التائية 16،17. أخيرا ، والثقافة في G - T ركس يقلل بشكل كبير من موت الخلايا المبرمج الخلية خلال الثقافة. تبادل الغازات (O 2 في 2 من أصل وأول أكسيد الكربون) ويحدث عبر غشاء السيليكون نفاذية الغاز في قاعدة القارورة ، ومنع نقص الأكسجين ، مما يسمح لقدر أكبر من عمق متوسط ​​فوق الخلايا ، وتوفير مزيد من المواد الغذائية وتخفيف النفايات والمنتجات. ويمكن أيضا أن يمتد هذا المنبر للفيروسات إضافية كما هو الحال عندما يتم تحديد مستضدات الواقية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D نظم </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> مصل الإنسان AB </td><td> شركة وادي الطبية الحيوية </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF - 1001B &amp; AAF - 1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection كيت </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP - 3012 </td></tr><tr><td> البلازميدات </td><td> NTC </td><td> ن / أ </td></tr><tr><td> GM - CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> 201 - LB - 025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206 - IL - CF </td></tr><tr><td> TNFα </td><td> R &amp; D </td><td> 210 - TA - 010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> سيغما </td><td> P6532 - 1MG </td></tr><tr><td> G - ريكس </td><td> ويلسون وولف التصنيع </td><td> AY11 - 00027 </td></tr></tbody></table>

generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant

الالتهابات الفيروسية تسبب الاعتلال والوفيات في خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT) المتلقين. لقد ولدت نحن وغيرنا بنجاح وأكسب خلايا تي محددة للفيروس ابشتاين بار (EBV) ، الفيروس المضخم للخلايا (CMV) واتش (إيج) باستخدام وحيدات الخلية تتحول EBV - lymphoblastoid (EBV ، LCL) الجينات المعدلة وراثيا مع ناقلات واتش خلايا مولدة تقديم (ناقلات الجنود المدرعة). عدد قليل من 2x10 5 / كغ trivirus محددة اللمفاويات التائية السامة للخلايا (CTL) التي انتشرت بعد عدة سجلات التسريب ويبدو لمنع وعلاج مرض فيروسي حاد حتى مقاومة للعلاجات المتوفرة الأخرى. يقتصر على نطاق أوسع تنفيذ هذا النهج تشجيع ارتفاع تكاليف الإنتاج والتعقيد الصنع والوقت لفترات طويلة (4-6 أسابيع لEBV LCL - جيل ، و4-8 أسابيع لصنع CTL -- المجموع 10-14 أسبوعا) للتحضير. للتغلب على هذه القيود وضعت لدينا جديد ، GMP المتوافقة مع بروتوكول إنتاج CTL. أولا ، في مكان adenovectors لتحفيز خلايا تي نستخدم الخلايا الجذعية (DCS) nucleofected مع الحمض النووي البلازميدات ترميز LMP2 ، وEBNA1 BZLF1 (EBV) ، وHexon بينتون (إيج) ، وpp65 وIE1 (CMV) وتقديم مستضد الخلايا. هذه ناقلات الجنود المدرعة تنشيط خلايا تي محددة لجميع مستضدات محفزة. الثانية ، وثقافة تنشيط خلايا تي في وجود IL - 4 (1000 يو / مل) ، وIL - 7 (10ng/ml) الزيادات وتحافظ على ذخيرة وتيرة معينة في الخلايا التائية خطوطنا. الثالثة ، وقد استخدمنا جديدة والغاز نفاذية الجهاز الثقافة (G - ريكس) أن يشجع على التوسع وبقاء أعداد كبيرة الخلية بعد التحفيز واحد ، وبالتالي إزالة شرط EBV ، والحد من التدخل LCLs فني. من خلال تنفيذ هذه التغييرات يمكن أن ننتج الآن CTL multispecific استهداف EBV ، CMV ، وإيج بتكلفة 6 10 في الخلايا التي خفضت بنسبة 90 ٪&gt; ، وفقط في 10 يوما بدلا من 10 أسابيع باستخدام النهج الذي يمكن تمديدها إلى إضافية المستضدات الفيروسية واقية. وينبغي لنا وافقت عليها الهيئة النهج تكون ذات قيمة لتطبيقات والعلاج الوقائي للمستلمين خطر HSCT خيفي عالية.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

والسريع ، وبروتوكول بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد المانحة المستمدة multivirus محددة CTLs (rCTL) للتسريب لخيفي الخلايا الجذعية المكونة للدم المستلمين (HSCT) زرع في خطر لتطوير CMV ، المحامي أو EBV العدوى. هذا هو عملية التصنيع GMP المتوافقة ، وينبغي ضمان تنفيذ أوسع تي خلية المناعي خارج المراكز المتخصصة.

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Views.  Baylor College of Medicine. والسريع ، وبروتوكول بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد المانحة المستمدة multivirus محددة CTLs (rCTL) للتسريب لخيفي الخلايا الجذعية المكونة للدم المستلمين (HSCT) زرع في خطر لتطوير CMV ، المحامي أو EBV العدوى. هذا هو عملية التصنيع GMP المتوافقة ، وينبغي ضمان تنفيذ أوسع تي خلية الم...

Video: Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...