عزل النوى المفردة من عضويات الدماغ البشري لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

للبدء ، انقل أربعة عضويات دماغية بشرية متولدة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى صفيحة من ستة آبار تحتوي على برنامج تلفزيوني مبرد. قطع كل عضوي إلى أربع قطع. باستخدام المقص ، اقطع طرف ماصة 1،000 ميكرولتر واستخدمه لنقل القطع العضوية إلى حارس سعة 2 ملليلتر.

نضح PBS تماما وإضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت تحلل NP-40. ارتد المواد العضوية ثلاث مرات باستخدام مدقة dounce A متبوعة بالمدقة B.نقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. اغسل الحارس بمليلتر واحد من محلول التحلل وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي.

بعد خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتعليق العضوي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق. نضح الطافع تاركا 50 ميكرولترا في الأنبوب. أضف ملليلتر واحد من وسيط NSB Plus في الأنبوب.

وبعد خمس دقائق ، اخلطي لإعادة تعليق الحبيبات. بعد تحضير تدرج Percoll في الأنبوب ، ضع طبقة من التعليق العضوي فوقه. بعد ذلك ، قم بطرد مركزي تعليق عضوي متعدد الطبقات عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط NSB Plus. قم بتصفية محلول النوى على مصفاة خلية 40 ميكرون. ثم قم بتلطيخ النوى باستخدام DAPI وعدها في غرفة نيوباور.

قم بطرد الكمية المطلوبة من محلول النوى وأعد تعليق الحبيبات في وسط NSB Plus وفقا لدليل مجموعة snRNA-seq القائم على الموائع الدقيقة.