للبدء ، قم بزراعة الإشريكية القولونية في 5 ملليلتر من Luria-Bertani ، أو LB ، متوسطة ، في أنبوب معقم من البوليسترين أو الزجاج. احتضان الأنبوب طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. الاستزراع الفرعي الثقافة المزروعة بين عشية وضحاها من 1 إلى 50 في 100 ملليلتر رطل في دورق مخروطي.
احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 1.5 ساعة تقريبا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من مخزون العاثية T4 عالي العيار إلى ثقافة E.coli واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة ثلاث ساعات. بمجرد أن تصبح محللة العاثية T4 واضحة ، اجمعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي المحللة في 4،000 غرام لمدة 20 دقيقة لحبيبات أي بكتيريا متبقية والحطام الخلوي. مرشح تعقيم طاف الناتج باستخدام مرشح النايلون 0.22 ميكرون ، وجمع المرشح إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. أضف 0.1 حجم الكلوروفورم إلى محلول العاثية T4 المصفى لقتل البكتيريا المتبقية ومنع نمو البكتيريا.
دوامة لفترة وجيزة ، واحتضان المحللة في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. أجهزة الطرد المركزي المحللة في 4،000 غرام لمدة خمس دقائق لفصل الكلوروفورم عن المحللة. باستخدام ماصة مصلية ، انقل بعناية طبقة المحللة العلوية إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.
أضف 13 ملليلتر من محلول العاثيات إلى الخزان العلوي لجهاز مرشح الطرد المركزي 100 كيلو دالتون. ركز المحللة عند 4،000 جم لمدة خمس دقائق ، أو حتى يمر معظم المحللة عبر الفلتر. باستخدام ماصة P200 أو P1000 ، قم برفق ماصة 2 ملليلتر المتبقية من المحللة لأعلى ولأسفل ، داخل الخزان العلوي ، لفك انسداد غشاء المرشح.
تخلص من المرشح من الخزان السفلي في حاوية نفايات. كرر التركيز ، واحتفظ بحوالي 2 ملليلتر من العاثية المركزة في الخزان العلوي. بعد الدوران الأخير ، ماصة بلطف المحللة المتبقية صعودا وهبوطا ، في الخزان العلوي.
لغسل محلول العاثية ، أضف 12 مل من المغنيسيوم المالح ، أو SM ، العازلة إلى الخزان العلوي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 4000 غرام لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق 2 ملليلتر المتبقية من المحللة في المخزن المؤقت SM إلى حجم نهائي يبلغ 10 ملليلتر. انقل المحللة إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا واحفظه عند 4 درجات سلزية.
لإزالة السموم الداخلية الملوثة ، أضف 0.4 حجم من 1-أوكتانول إلى الحجم الكلي للمحلل. أغلق غطاء الأنبوب بغشاء مانع للتسرب واهتز عند 120 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة ، تليها الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة دون اهتزاز. أجهزة طرد مركزي لفصل المحللة التي تم تطهيرها من السموم الداخلية عن 1-أوكتانول.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من 1-أوكتانول بعناية ، باستخدام ماصة P1000 ، وتخلص منها في حاوية النفايات المناسبة. باستخدام إبرة قياس 18 وحقنة 10 ملليلتر ، اجمع محلول العاثية تحت طبقة 1-أوكتانول المتبقية. نقل 1 ملليلتر من محللات العاثية T4 إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة 1.5 ملليلتر.
قم بتفريغ الأنابيب بسرعة مع فتح الأغطية عند 4،000 جم لتبخر 1-أوكتانول المتبقي من المحلل. قم بإعداد تخفيف تسلسلي لتحلل العاثيات بعوامل 10 ، ثم حدد 5 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار LB ، واحتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، عد اللويحات لحساب وحدات تكوين البلاك ، أو PFU.
تمييع المخزن المؤقت الناتج المحللة و SM إلى التركيز المطلوب ، و retiter للتأكيد. قم بتخزين المحللة المركزة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
