عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة لتحليل التعبير الجيني

1 بعد تشريح scBAT2 من الفأر القتل الرحيم ، 3 ضع الأنسجة على الفور في أنبوب طرد مركزي صغير. 4 اصنع ثقبا في الجزء العلوي من الأنبوب بإبرة معقمة 5 وقم بتجميد النيتروجين السائل. 6 انقع مدقة وملعقة رقيقة في النيتروجين السائل.

7 صب عينة الأنسجة المجمدة المفاجئة 8 من أنبوب الطرد المركزي الصغير في الملاط. 9 أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل إلى الهاون 10 وطحن الأنسجة جيدا باستخدام المدقة 11 حتى تسحق تماما. 12 استخدم الملعقة الرفيعة لكشط ونقل 13 الأنسجة المسحوقة مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.

14 بمجرد نقل جميع الأنسجة, 15 أضف 500 ميكرولتر من محلول عزل الحمض النووي الريبي إلى الأنبوب 16 وصوتنة لمدة 30 ثانية باستخدام محرك مدقة الحبيبات. 17 بعد ذلك ، استخدم حقنة للماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات 18 لمزيد من قمل الأنسجة ، 19 لضمان عدم ظهور جزيئات صلبة. 20 أضف 250 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة من حين لآخر 21 خلال خمس دقائق ، حضانة درجة حرارة الغرفة.

22 الطرد المركزي العينات عند 21 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة 23 عند أربع درجات مئوية. 24 انقل الطبقة المائية العلوية إلى أنبوب جديد 25 وأضف كمية مكافئة من 70٪ من الإيثانول. 26 نقل 500 ميكرولتر من المحللة 27 إلى عمود ملزم.

28 جهاز طرد مركزي عند 18 ، 000 جم لمدة 60 ثانية 29 وتخلص من المرشح. 30 للنسخ العكسي ، أضف 0.5 إلى ميكروغرام واحد 31 من الحمض النووي الريبي المخفف في الماء المعالج DEPC إلى شريط أنبوب PCR. 32 ثم قم بتخفيف CDNA إلى 250 نانوغرام لكل ميكرولتر 33 باستخدام المياه المعالجة DEPC وقم بإعداد PCR الكمي.

34 كانت مستويات التعبير عن جينات العلامات المشاركة 35 في التوسط في وظيفة scBAT متشابهة نسبيا 36 بين scBAT والخفافيش بين الكتف.