للبدء ، قم بإعداد هلام SDS-PAGE. قم بتدوير العلامة المذابة وعينات مقايسة التحول الحراري الخلوي المحضرة. أضف 2.5 ميكرولتر من العلامة إلى البئر الأول و 20 ميكرولترا من العينات إلى كل من الآبار المتبقية.
ثم قم بتشغيل الجل عند 80 فولت. بعد ذلك ، أضف 850 ملليلترا من الماء عالي النقاء ، و 100 ملليلتر من الإيثانول اللامائي ، و 50 ملليلترا من محلول النقل السريع إلى دورق ، وحركه جيدا. قطع فلوريد البولي فينيليدين أو غشاء PVDF وفقا لحجم الجل ، ووضع علامة عليه.
ثم انقعه في الميثانول لمدة 30 ثانية لتنشيطه. ضع مشابك النقل والوسادة الإسفنجية وثلاث طبقات من ورق ترشيح النقل في صينية تحتوي على المخزن المؤقت للنقل. بمجرد اكتمال الرحلان الكهربائي ، اسكب محلول الرحلان الكهربائي من جهاز الرحلان الكهربائي وقم بإزالة اللوحة.
قم بإزالة الجل برفق بسكين بلاستيكي وقم بقصه لتصور علامة البروتين والبروتينات المستهدفة بوضوح. بعد غسل الجل في محلول الغشاء ، ضعه بشكل مسطح على ورق الترشيح. اغمس غشاء PVDF المنشط في محلول النقل.
امسك الجانب المسمى بملاقط وقم بتغطية وجه الجل لأسفل. بعد ذلك ، ضع إعداد النقل المجمع في خزان النقل. أضف المحلول المتبقي عبر الغشاء إلى الدرج عبر الغشاء.
اضبط التيار والوقت ، واضغط على تشغيل لبدء النقل في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف ستة ملليلتر من محلول 5٪ BSA مع TBST إلى صندوق الحضانة. بمجرد اكتمال النقل ، قم بإزالة غشاء PVDF من الإعداد أثناء تثبيت جانب العلامة ووضعه في صندوق الحضانة.
بعد إزالة محلول BSA من صندوق الحاضنة ، أضف ستة ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية. ضع صندوق الحضانة في صندوق رغوي به أكياس ثلج طوال الليل أثناء الرج. في اليوم التالي ، اجمع الجسم المضاد الأساسي في أنبوب ، واغسل الغشاء بستة ملليلتر من محلول TBST.
بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من الجسم المضاد الثانوي إلى صندوق الحضانة. في نهاية الحضانة ، اجمع الجسم المضاد الثانوي واغسل الغشاء خمس مرات باستخدام TBST كما هو موضح سابقا. امزج كميات متساوية من الكواشف الكيميائية A و B.افتح نظام التصوير الهلامي.
انقر فوق العينات ، وتحقق من المعايرة ، وانتظر حتى تكتمل المعايرة. ثم ، انقر فوق علامة وتحقق من المعايرة. الآن التقط جانب العلامة من الشريط بملاقط وانغمس تماما في محلول الكاشف الكيميائي.
قم بربط جانب واحد من العلامة لوضع الشريط بحيث يكون وجهه لأسفل في جهاز التصوير، وأغلق غطاء جهاز التصوير. اضبط وقت التعرض على ثانية واحدة ، وانقر فوق التقاط. انقر على حفظ.
قم بتسمية الصورة واحفظها كملف TIFF. أظهر اختبار التحول الحراري الخلوي أن Xanthatin يحول بشكل ملحوظ الاستقرار الحراري لبروتين Keap1 ضمن نطاق درجة حرارة 48 إلى 57 درجة مئوية مقارنة بمجموعة ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
