تحليل وظيفة الميتوكوندريا في المستعمرات الصغيرة التي يسببها البروميديوم من المبيضات غلابراتا

لبدء زراعة المبيضات glabrata ، قم بترتيب جميع المواد التجريبية على منصة العمل. اختر مستعمرة واحدة من C.glabrata من خميرة بيبتون دكستروز أو صفيحة YPD Agar. ونقله إلى أنبوب اختبار زجاجي يحتوي على 3 ملليلتر من وسط YPD.

احتضان لمدة 14 إلى 16 ساعة عند 25 درجة مئوية مع الهز عند 155 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، قم بتخفيف الثقافة في YPD الطازج للحصول على كثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر من 0.1. احتضان الثقافة المخففة عند 25 درجة مئوية لمدة ست ساعات مع الهز عند 155 دورة في الدقيقة.

تحضير معلق الخميرة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.1 في YPD إلى 3 ملليلتر. أضف 30 ميكرولترا من مخزون بروميد الإيثيديوم ، واحتضن معلق الخميرة طوال الليل عند 25 درجة مئوية عند 155 دورة في الدقيقة بزاوية 45 درجة. في اليوم التالي ، اضبط الكثافة البصرية للثقافة إلى 0.65 باستخدام وسيط YPD جديد.

في صفيحة بئر 96 ، أضف 20 ميكرولترا من تعليق الخميرة إلى 180 ميكرولترا من PBS لكل بئر لتخفيف عشرة أضعاف. لوحة 20 ميكرولتر من كل تخفيف على أربعة أرباع من لوحة YPD Agar. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، حدد الأرباع التي تحتوي على خمسة إلى 80 مستعمرة وأضف 20 ميكرولترا من 20٪ ثلاثي فينيل تيترازوليوم. وأضف 20 ميكرولترا من كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الفينيل 20٪ مباشرة إلى وسط كل مستعمرة. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 40 دقيقة.

امسح اللوحات ضوئيا بدقة 1200 نقطة في البوصة باستخدام ماسح ضوئي بالألوان الكاملة 48 بت. عامل إقحام الحمض النووي ، بروميد الإيثيديوم ، يحفز بشكل فعال طفرات صغيرة من C.glabrata.