تحليل وظيفة الميتوكوندريا في العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للفطريات الناجم عن المستعمرات الصغيرة من المبيضات غلابراتا

للبدء ، ضع ثقافة المبيضات Glabrata ووسيط YPD على منصة عمل. اضبط الكثافة البصرية لتعليق خلية الخميرة عند 600 نانومتر إلى 0.65 باستخدام وسيط YPD. امزج ملليلتر واحد من تعليق الخميرة مع 111 ميكرولتر من 2٪ روز البنغال في أنبوب دائري مغطى.

احتضان الخليط عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، بالتناوب بزاوية 45 درجة عند 155 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، انقل الخليط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر ، وأجهزة طرد مركزي عند 16،100 غرام لمدة 2.5 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وكشط الأنبوب برفق خمس مرات لإعادة تعليق الحبيبات.

اغسل التعليق باستخدام PBS أربع مرات لإزالة كل روز البنغال. بعد الغسيل النهائي ، انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخميرة المحمل ب Rose Bengal إلى كل من الآبار الثلاثة في صفيحة بئر 96. ضع اللوحة على نظام الإضاءة الديناميكية الضوئية مع مصابيح LED التي تسلط الضوء الأخضر من الأسفل.

قم بتنشيط نظام إضاءة LED لتقديم جرعة العلاج الضوئي الديناميكي البالغة 4.38 جول لكل سنتيمتر مربع على مدار دقيقتين. بعد التشعيع ، أضف 20 ميكرولترا من تعليق الخميرة إلى بئر يحتوي على 180 ميكرولترا من PBS ، مما يؤدي إلى تخفيف عشرة أضعاف. لكل عامل تخفيف ، لوحة 20 ميكرولتر لكل ربع على ألواح البريمة YPD.

اقلب اللوحة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات في كل ربع. باستخدام الصيغة المعطاة ، احسب وحدات تشكيل المستعمرة لكل ملليلتر.

أضف 20 ميكرولترا من كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الفينيل 20٪ مباشرة إلى وسط كل مستعمرة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 40 دقيقة. امسح اللوحات ضوئيا بدقة 1،200 نقطة في البوصة باستخدام ماسح ضوئي بالألوان الكاملة 48 بت. بعد تحضير تعليق خميرة TZero في مرحلة النمو المتأخر ، قم بتعريضها ل 4.38 جول لكل سنتيمتر مربع من الضوء الأخضر في وجود 0.2٪ روز البنغال.

تدل على الفطريات الباقية على قيد الحياة مثل T-1. تعريض الفطريات الباقية لنفس جرعة PDT. أظهرت الطفرات الصغيرة من C-Glabrata نموا أبطأ مقارنة بالفطريات الأبوية غير المعالجة ذات الحجم العادي.

أدى علاج ديناميكي ضوئي واحد مضاد للميكروبات إلى تثبيط نمو C-Glabrata بشكل كبير بمقدار ثلاثة تأخيرات مقارنة بالمجموعة الضابطة. C-Glabrata ، بعد 24 ساعة من العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات ، أظهر توزيعا لحجم مستعمرة ثنائية النمط مع مستعمرات صغيرة كبيرة وصغيرة. أظهرت المستعمرات الصغيرة التي حافظت على اللون الأبيض خللا وظيفيا في الميتوكوندريا ، بينما احتفظت بعض المستعمرات ذات اللون الأحمر الأصغر والمستعمرات ذات الحجم الطبيعي بوظيفة الميتوكوندريا الطبيعية.