للبدء ، انقل كامل ثقافة HEK293 المرتبطة بالفيروس الغدي PEG المترسب إلى أنبوب مخروطي كبير. أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 2،820 غرام لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم.
انقل الجزء المعاد تعليقه إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. أضف 10 ملليلتر من PBS لجمع راسب PEG المتبقي ، وانقله إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. ثم أضف 40 ميكرولترا من DNase I ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، املأ أنبوب متعدد الألوان 25 مم × 89 ملم ب 15.5 ملليلتر من محللات الخلايا المركزة. باستخدام ماصة باستور الزجاجية الجديدة ، قم بنقع تسعة ملليلتر برفق من محلول اليوديكسانول 15٪ أسفل محلول الخلية. ثم أضف خمسة ملليلتر من محاليل اليوديكسانول 25٪ و 40٪.
وأخيرا ، أضف خمسة ملليلتر من محلول اليوديكسانول 60٪. استخدم حقنة لتعبئة الأنبوب ببرنامج تلفزيوني ، مما يضمن إزالة معظم فقاعات الهواء دون إزعاج طبقات اليوديكسانول. أغلق الأنبوب باستخدام غطاء أنبوب كهربائي.
تأكد من أن الطبقات المختلفة لتدرج اليوديكسانول مرئية بوضوح. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب باستخدام دوار غير متأرجح عند 490،000 غرام لمدة ساعة و 10 دقائق عند 16 درجة مئوية. عند الطرد المركزي ، قم بتجميع الأنابيب في قفل معدني.
نعلق إبرة قياس 19 إلى حقنة. بعد ذلك ، قم بإنشاء ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب باستخدام إبرة قياس 30 ، مع ترك الإبرة مدخلة. قم بثقب الأنبوب بعناية أسفل واجهة 40٪ 60٪ iodixanol ، كما هو موضح بمؤشر الفينول الأحمر.
تأكد من أن شطبة الإبرة تواجه طبقة 40٪. قم بإزالة إبرة قياس 30 باليد غير المهيمنة أثناء استخراج خليط الفيروس واليوديكسانول ببطء. في منتصف الطريق تقريبا ، قم بتدوير الإبرة حتى يكون الشطبة متجهة لأسفل ، واستمر في الاستخراج ، وتجنب التجمع من طبقة البروتين.
بعد الاستخراج ، انقل أنبوب الطرد المركزي الفائق على الفور إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر للتخلص منه. أضف تعليق AAV-iodixanol الذي تم جمعه إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ، وقم بتخفيفه خمسة أضعاف في PBS ، وملء ما يصل إلى 15 ملليلتر. انقل التعليق إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 3،428 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
بعد التخلص من التدفق ، أضف 15 ملليلترا من السكروز PBS 5٪ إلى المرشح وأعيد استخدامه. جمع AAV المركزة من أنبوب مرشح الطرد المركزي. أخيرا ، قم بتخزين حصولة الفيروس عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
