تم دعم هذا العمل بمنحة من صندوق أبحاث الأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) ومنحة من Start2Cure (0-TI-01). نشكر ليشا كوب على مساهمتها ونصائحها في إعداد البروتوكول. تم إنشاء الأرقام باستخدام Biorender.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للعلوم (KNAW) وكانت متوافقة مع القانون الهولندي بشأن التجارب على بموجب المشروع رقم AVD8010020199126. في الشكل 1 ، يتم توفير نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل. من خلايا البذر إلى تنقية AAV ، يستغرق البروتوكول 6 أيام حتى يكتمل.
1. إعداد الكاشف
<ol><li>تنقية البلازميد<ol><li>إجراء استخراج البلازميد كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة مع بعض التعديلات لضمان عقم البلازميدات.</li>
		<li>تحضير 70 ٪ من الإيثانول باستخدام الماء المقطر المعقم والإيثانول المطلق.</li>
		<li>بعد خطوة الطرد المركزي الأيزوبروبانول ، جفف البلازميدات في غطاء خزانة التدفق وأضف 70٪ إيثانول معقم إلى الأنابيب. بعد ترسيب الإيثانول ، جفف البلازميدات في غطاء خزانة التدفق وأعد تعليق البلازميد في الماء المقطر المعقم. احرص على استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة.</li>
		<li>خذ حصة للقياس الكمي ، وتحليل التقييد ، وإذا لزم الأمر ، التسلسل. ينصح بالتحقق من سلامة التكرارات الطرفية المقلوبة (ITR) لأن الطفرات يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على العائد. اضبط تركيز العينة على 1 ميكروغرام / ميكرولتر.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد 10x المخزن المؤقت لتحلل توين<ol><li>قم بإذابة 30.3 جم من محلول Tris و 2.033 جم MgCl2.6H 2O في 400 مل من الماء المقطر المعقم ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 ، وقم بزيادة الحجم الكلي إلى 450 مل.</li>
		<li>حافظ على Tween 20 معقما ، وأضف 50 مل من Tween 20 إلى محلول المخزن المؤقت في غطاء المحرك ، وقم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح تفريغ 0.2 ميكرومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>تخفيفات يوديكسانول<ol><li>يتم توفير محلول يوديكسانول بتركيز 60٪. استخدم حل البدء لعمل حلول 15٪ و 25٪ و 40٪.</li>
		<li>بالنسبة لمحلول 15٪ ، قم بتخفيف 60 مل من محلول 60٪ مع 48 مل من 5 M NaCl و 48 مل من PBS-MK (5x PBS مع 5 mM MgCl2 و 12.5 mM KCl) ، وأضف الماء المقطر حتى 240 مل.</li>
		<li>بالنسبة لمحلول 25٪ ، قم بتخفيف 67 مل من محلول 60٪ و 32 مل من PBS-MK. أضف الماء المقطر حتى 160 مل. تخلط جيدا وتضاف 1.6 مل من محلول الفينول الأحمر.</li>
		<li>بالنسبة لمحلول 40٪ ، قم بتخفيف 160 مل من محلول 60٪ مع 48 مل من PBS-MK وأضف الماء المقطر حتى 240 مل. بالنسبة لمحلول 60٪ ، أضف 1 مل من الفينول الأحمر إلى 100 مل من محلول 60٪.</li>
	</ol></li>
	<li>برنامج تلفزيوني 5٪ محلول السكروز<ol><li>أضف 25 جم من السكروز إلى زجاجة سعة 500 مل من DPBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. رج العبوة جيدا وقم بالتصفية باستخدام مرشح تفريغ زجاجة 0.2 ميكرومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>محلول البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000<ol><li>قم بإذابة 400 جم من PEG 8000 و 24 جم من كلوريد الصوديوم في ماء مقطر معقم واضبطه على الحجم النهائي البالغ 1000 مل. يقلب مع التدفئة حتى يذوب تماما. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام ورق الأس الهيدروجيني.</li>
		<li>تعقيم الفلتر باستخدام مرشح تفريغ زجاجة 0.2 ميكرومتر للحصول على محلول PEG 8000 بنسبة 40٪. لاحظ أن الترشيح سيستغرق بعض الوقت بسبب لزوجة مخزن المحلول عند 4 درجات مئوية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ثقافة خلايا التعليق HEK293
<ol><li>استخدم مناديل مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول للتنظيف. تنظيف غطاء السلامة الحيوية وإعداد وتنظيف جميع المواد اللازمة لزراعة الخلايا.</li>
	<li>سخن 30 مل من الخلية المعلقة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب زراعة مخروطي 50 مل. استرجع خلايا الإنتاج الفيروسي من النيتروجين السائل. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قبل إذابة القارورة تماما ، قم بتنظيفه بمنديل منقوع في 70٪ من الإيثانول ونقل القارورة إلى غطاء الأمان الحيوي. ملاحظة: يتم توفير تفاصيل خلايا الإنتاج الفيروسي المستخدمة هنا في جدول المواد.</li>
	<li>انقل الخلايا بسرعة إلى أنبوب الزراعة المخروطي سعة 50 مل المسخن مسبقا. خلايا استزراع في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 80٪ ، 8٪ CO2 ، 200 دورة في الدقيقة (RPM) ، وقطر اهتزاز 50 مم. خلايا المرور ، بمجرد أن تكون الصلاحية أعلى من 90٪ وكثافة الخلية أعلى من 1-3 × 106 خلايا / مل. ملاحظة: الحاضنة المستخدمة لها قطر اهتزاز 50 مم ؛ يجب ضبط ظروف الاستزراع لقطر اهتزاز مختلف.</li>
	<li>خلايا المرور 3-4 أيام بعد ذوبان الجليد. فحص أنبوب (أنابيب) المزرعة للتأكد من عدم وجود علامات تلوث ؛ على سبيل المثال ، ستظهر الفطريات كحلقة متغيرة اللون (سوداء أو خضراء).</li>
	<li>قم بإعداد 400 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق 0.4٪ لكل عينة باستخدام شريط 1 مل.</li>
	<li>استرداد الخلايا المعلقة بسرعة من الحاضنة. استخراج 500 ميكرولتر على الفور من الأنبوب باستخدام شريط 1 مل. ماصة بلطف صعودا وهبوطا.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب التريبان الأزرق المحضر. اقلب الأنبوب برفق لخلطه ؛ لا تخلط الماصة ، لأن هذا سيؤدي إلى موت الخلايا. إعادة الخلايا إلى الحاضنة.</li>
	<li>خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا المعالجة باللون الأزرق المثقب وقم بتطبيقه على شريحة مقياس الدم. عد إجمالي الخلايا القابلة للحياة واحسب كمية تعليق الخلية والوسط اللازم للمرور أو النقل في اليوم التالي.</li>
	<li>وسط دافئ في الحاضنة لمدة 10-15 دقيقة. أضف تعليق الخلية إلى الوسط الدافئ والعودة إلى الحاضنة. لتمرير الخلايا لمدة 3 أيام (أي من الاثنين إلى الخميس) ، اضبط على 0.5 × 106 خلايا / مل ؛ لتمرير الخلايا لمدة 4 أيام (أي من الخميس إلى الاثنين) ، اضبط على 0.3 × 106 خلايا / مل. ملاحظة: وفقا للشركة المصنعة ، تتضاعف خلايا الإنتاج الفيروسي كل 26 ساعة ويجب أن تكون بين 3.5 × 106 و 5.5 × 106 قبل المرور. يمكن الاحتفاظ بالخلايا لمدة تصل إلى الممر 20.</li>
</ol>3. النقل
<ol><li>اليوم 1<ol><li>في 24 ساعة قبل النقل ، ثقافة 1 × 106 خلايا لكل / مل في 300 مل من الوسائط.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 2<ol><li>وسط دافئ ، بلازميدات ، وكاشف نقل إلى درجة حرارة الغرفة. وللاطلاع على المبالغ التي يتعين إعدادها، انظر الجدول 1.</li>
		<li>لفترة وجيزة البلازميدات الدوامة والكواشف. أضف البلازميدات إلى الوسط المحضر ، دوامة. أضف كاشف النقل والدوامة لفترة وجيزة. لا تحرك الخليط بعد هذه الخطوة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>في غضون ذلك ، عد الخلايا المعدة في اليوم 1. يجب أن تكون الخلايا بين 2 و 2.5 × 106 خلايا لكل مل > 95٪ قابلة للحياة.</li>
		<li>بعد الحضانة ، بالتنقيط ، أضف خليط النقل إلى الخلايا أثناء تدوير الأنبوب برفق. احتضان لمدة 72-96 ساعة.</li>
	</ol></li>
</ol>4. حصاد الخلايا
<ol><li>اليوم 5<ol><li>أضف 33 مل من محلول تحلل الخلايا 10x (500 مللي متر Tris pH 8 ، 10٪ Tween 20 ، 20 mMMgCl 2) ، اخلطه بالرج برفق ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع الرج.</li>
		<li>جهاز طرد مركزي عند 3428 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بالتصفية من خلال مرشح فراغ PES 0.45 ميكرومتر لتوضيح تحلل الخلية ، مع ترك المحللة الموضحة في حاوية الفلتر. ملاحظة: اختياري بعد الترشيح: خذ 50 ميكرولتر من العينة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Q-PCR).</li>
		<li>أضف 90 مل من محلول PEG 8000 بنسبة 40٪ إلى 360 مل من محلول الخلايا المفلترة.</li>
		<li>نظف شريط التحريك بنسبة 70٪ إيثانول وأضفه إلى العينة. يقلب على الجليد أو في الغرفة الباردة عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. احتضان على حرارة 4 درجة مئوية دون التقليب طوال الليل. ملاحظة: تم اختبار أوقات الحضانة من 1 ساعة إلى 72 ساعة. أوقات الحضانة الأطول لها تأثير سلبي على ترسيب البروتين الكلي.</li>
	</ol></li>
</ol>5. تنقية يوديكسانول
<ol><li>اليوم 6<ol><li>انقل عينة حجم الاستزراع المترسب PEG بالكامل إلى أنبوب مخروطي كبير نظيف وجهاز طرد مركزي عند 2820 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات PEG في 15 مل من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. من الصعب إنعاش الحبيبات ؛ خذ الوقت الكافي للقيام بذلك بعناية.</li>
		<li>انقل الجزء المعاد تعليقه إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل. سيبقى PEG على جانبي أنبوب المفاعل الحيوي. أضف 10 مل إضافية ، مع الحرص على جمع كل راسب PEG. انقل الكل إلى حاوية سعة 50 مل لحجم إجمالي يتراوح بين 25 و 30 مل.</li>
		<li>أضف 40 ميكرولتر من DNaseI (10 وحدة / ميكرولتر). ضعه في الحاضنة لمدة 1 ساعة 37 درجة مئوية. ملاحظة: اختياري بعد حضانة DNase: خذ 50 ميكرولتر من العينة ل Q-PCR.</li>
		<li>نظف قضبان التقليب التي تم استخدامها لترسيب PEG جيدا بمحلول كلوريد متبوعا ب 70٪ إيثانول. اترك قضبان التحريك في 70٪ إيثانول للتجربة التالية.</li>
		<li>املأ أنبوب بولي ألومر 25 مم × 89 مم باستخدام ماصة باستور زجاجية مع 15.5 مل من محللات الخلايا المركزة في كل أنبوب. بعد إضافة محللة الخلية ، استبدل ماصة باستور الزجاجية بأخرى جديدة.</li>
		<li>أضف محاليل اليوديكسانول من 15٪ -60٪: اغرس 9 مل من محلول اليوديكسانول 15٪ برفق تحت محلول الخلية. بعد ذلك ، أضف 5 مل من محاليل اليوديكسانول 25٪ و 40٪ ، وأخيرا ، أضف 5 مل من محلول اليوديكسانول 60٪.</li>
		<li>قم بإغلاق الأنبوب باستخدام حقنة مع DPBS +/+ لإزالة معظم فقاعات الهواء ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقات اليوديكسانول. أغلق الأنبوب باستخدام غطاء أنبوب كهربائي.</li>
		<li>جهاز طرد مركزي في دوار غير متأرجح لمدة 1 ساعة و 10 دقائق عند 490000 × جم عند 16 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي فائق. قم بإزالته من أجهزة الطرد المركزي الفائقة ، وقم بتجميع الأنابيب في قفل معدني ، وقم بإعداد أنابيب التجميع. افتح الدوار في غطاء المحرك في حالة الانسكابات أثناء الدوران.</li>
		<li>قم بإعداد أنبوب واحد سعة 50 مل (للتخلص من الأنبوب الدوار) ، وأنبوب واحد سعة 15 مل (لتجميع الفيروسات) ، ومحقنة سعة 5 مل ، وإبرة 30 جم و 19 جم لكل تدرج.</li>
		<li>ثقب ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب بإبرة 30G. اترك الإبرة في مكانها. ضع إبرة 19G على المحقنة.</li>
		<li>ثقب الأنبوب بعناية أسفل واجهة 40٪ / 60٪ مباشرة ، والتي يمكن رؤيتها بواسطة مؤشر الفينول الأحمر. تأكد من أن شطبة الإبرة تواجه طبقة 40٪.</li>
		<li>قم بإزالة إبرة 30G من أعلى الأنبوب باستخدام اليد غير المهيمنة. مع مشطوفة الإبرة ، استخرج الفيروس / اليوديكسانول ببطء. الهدف هو استخراج ما بين 3 مل و 4.5 مل. في منتصف الطريق تقريبا وفي الطبقة الشفافة 40٪ / ، قم بتدوير الإبرة حتى يصبح الشطبة متجهة لأسفل واستمر في الاستخراج لتجنب التجمع من طبقة البروتين.</li>
		<li>قم بإعداد أنبوب 50 مل باليد غير المهيمنة ، واستخرج الإبرة بعناية أثناء وضع الأنبوب في أنبوب 50 مل وتخلص منه. قم بتخفيف تعليق AAV / iodixanol 5x في DPBS عن طريق ملء ما يصل إلى 15 مل.</li>
		<li>نقل إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 3428 × ز ، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل التدفق من خلال ؛ قم بإزالة حامل الفلتر برفق وقم بقلب الحاوية السفلية في زجاجة نفايات. أضف 15 مل من السكروز PBS-5٪ للترشيح وإعادة التأهيل.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي عند 3428 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر تبادل المخزن المؤقت 3x على الأقل. تخزين الفيروس (~ 150-250 ميكرولتر) في 4 °C (PHP. المتغيرات B بحد أقصى 3 أشهر) أو القسمة إلى 50 ميكرولتر من القسمة وتخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل. ملاحظة: PHP. متغيرات قفيصة B حساسة للتجميد / الذوبان ، لذلك يجب تجنب ذلك.</li>
		<li>قم بإجراء المعايرة بالتحليل الحجمي كما هو موضح في البروتوكولالسابق 10.</li>
	</ol></li>
</ol>

إنتاج AAV مبسط وفعال باستخدام ثقافة التعليق HEK293

<ol>
	<li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases.">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).</li><li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration.">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood&#8211;brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system.">Several rAAV vectors efficiently cross the blood&#8211;brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li><li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset.">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960 (2019).</li><li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li><li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy,+methods+and+protocols.">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li><li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addgene+AAV+data+hub:+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data.">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li><li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li><li>Blessing, D., D&#233;glon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells,+methods+and+protocols.">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li></ol>

تم تقديم عينة مجانية من TransIT بواسطة Mirus للاختبار الأولي ، وبعد ذلك تم شراء الكاشف لمزيد من الاستخدام. ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أخرى للإبلاغ عنها.

الإدارة الجهازية ل AAV هي أداة قوية لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن إنتاج AAV هو عملية مكلفة وشاقة. باستخدام خلايا التعليق ، يتم تقليل العمالة والبلاستيك مقارنة بالثقافة الملتصقة HEK293T على ألواح 15 سم2 . علاوة على ذلك ، فإن الأنابيب المخروطية المنفذة هنا سهلة التعامل ?...

تم اكتشاف الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في عام 1965 ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في عدد لا يحصى من التطبيقات1. تم تطبيق AAVs في أبحاث علم الأعصاب لدراسة الجينات والوظيفة العصبية ، أو رسم خرائط للدوائر العصبية ، أو إنتاج نماذج حيوانية للمرض2. تقليديا ، يتم ذلك عن طريق الحقن مباشرة في موقع الاهتمام ، لأن معظم الأنماط المصلية الطبيعية لا تعبر حاجز الدم في الدماغ أو تحتاج إلى جرعة عالية للقيام بذلك1،2،3.
مع اكتشاف AAV. PHP.B4 والجيل التالي من القفيصات مثل AAV. PHP.eB5 و AAV. CAP-B106 ، من الممكن استهداف الجهاز العصبي المركزي (CNS) باستخدام حقن جهازي بسيط. يكشف رسم الخرائط المكانية عن الخلايا التي تستهدفها AAV. PHP.eB على المستوى الخلوي 6,7. بالاقتران مع المروجين / المعززات المحددة ، توفر هذه القفيصات فرصا واسعة لعلماء الأعصاب لدراسة الجينات ووظائف المخ عن طريق توصيل AAV غير الغازية 4,8.
في حين أن هناك حاجة إلى جرعة أقل ل AAV. PHP.eB (عادة من 1 إلى 5 × 1011 نسخة جينوم (GC) / ماوس) مقارنة ب AAV9 (4 × 1012 GC / ماوس) 7 ، لا يزال يتعين إنتاج المزيد من المتجهات مقارنة باستراتيجيات الحقن المباشر (عادة 1 × 109 GC / μL حقن). يمكن إنتاج معظم الأنماط المصلية الطبيعية باستخدام نظام زراعة الخلايا الملتصقة الكلاسيكي بالاشتراك مع تنقية اليوديكسانول9،10،11،12. ل AAV. PHP.eB يستلزم هذا عملية كثيفة العمالة لزراعة الخلايا ونقلها للحصول على ناقلات كافية لتجربة واحدة8. لذلك ، تم تطوير إنتاج AAV في زراعة الخلايا المعلقة في الأنابيب المخروطية. الأنابيب المخروطية ، بسعة تصل إلى 300 مل ، مدمجة ، مما يوفر مساحة الحاضنة والبلاستيك. خلايا التعليق أسهل بكثير في الزراعة والتعامل بكميات كبيرة من الخلايا الملتصقة على ألواح 15 سم. تظل مكونات النقل في البروتوكول كما هي. لذلك ، يمكن بسهولة استخدام البلازميدات المستخدمة سابقا مع النظام الملتصق في هذا البروتوكول بناء على الإنتاج في الخلايا المعلقة. تم نقل البروتوكول بنجاح إلى باحثين آخرين في المختبر واستخدم بنجاح لمختلف القفيصات والتركيبات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5920701002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>587633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5820747005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5948000315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 600 ml cell culture tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>66129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Minitron 50 mm</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>500043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-MAX Production Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3583401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Tray Universal</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep - Iodixanol</td>
			<td>Serumwerk bernburg</td>
			<td>1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-VirusGEN</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mir 6706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-50ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-600ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Production Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28932363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-yield adeno associated vector batches using hek293 suspension cells

النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAVs) هي أداة رائعة للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي (CNS). قفيصات مبتكرة ، مثل AAV. PHP.eB ، تظهر نقيضا واسعا للجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن في الوريد في الفئران. لتحقيق نقل مماثل ، هناك حاجة إلى عيار أعلى بمقدار 100 ضعف (الحد الأدنى من 1 × 1011 نسخة جينوم / فأر) مقارنة بالحقن المباشر في حمة الجهاز العصبي المركزي. في مجموعتنا ، إنتاج AAV ، بما في ذلك AAV. يعتمد PHP.eB على خلايا HEK293T الملتصقة وطريقة النقل الثلاثي. إن تحقيق غلات عالية من AAV مع الخلايا الملتصقة يستلزم عملية كثيفة العمالة والمواد. دفع هذا القيد إلى تطوير بروتوكول لزراعة الخلايا القائمة على التعليق في الأنابيب المخروطية. تمت مقارنة AAVs المتولدة في الخلايا الملتصقة بطريقة إنتاج التعليق. تمت مقارنة الثقافة في التعليق باستخدام كواشف النقل Polyethylenimine أو TransIt. تم تنقية ناقلات AAV بواسطة الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول متبوعا بتبادل المخزن المؤقت والتركيز باستخدام مرشح الطرد المركزي. باستخدام طريقة الالتصاق ، حققنا متوسط 2.6 × 1012 نسخة جينوم إجمالا (GC) ، في حين أن طريقة التعليق و Polyethylenimine أنتجت 7.7 × 1012 GC في المجموع ، وأسفرت TransIt عن 2.4 × 1013 GC في المجموع. لا يوجد فرق في كفاءة النقل في الجسم الحي بين النواقل المنتجة مع الالتصاق مقارنة بنظام خلية التعليق. باختصار ، تم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على خلية التعليق HEK293 ، مما أدى إلى تقليل مقدار الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل مع تحقيق عوائد أعلى من 3 إلى 9 مرات باستخدام المكونات المتاحة من البائعين التجاريين لأغراض البحث.

Adeno-associated virus (AAV) was discovered in 1965 and has since been used in a myriad of applications1. AAVs have been applied in neuroscience research to study gene and neuronal function, map neurocircuits, or produce animal models for disease2. Traditionally, this is done by injecting directly at the site of interest, as most natural serotypes do not cross the blood-brain barrier or need a high dose to do so1,2,3.
With the discovery of AAV.PHP.B4 and next-generation capsids such as AAV.PHP.eB5 and AAV.CAP-B106, it is possible to target the central nervous system (CNS) using a simple systemic injection. Spatial mapping reveals the cells targeted by AAV.PHP.eB at cellular level6,7. In combination with specific promoters/enhancers, these capsids offer extensive opportunities for neuroscientists to study genes and brain function by non-invasive AAV delivery4,8.
While a lower dose is needed for AAV.PHP.eB (typically 1 to 5 x 1011 Genome Copies (GC)/mouse) compared to AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7, still more vector needs to be produced compared to direct injection strategies (typically 1 x 109 GC/&#181;L injection). Most natural serotypes can be produced using the classical adherent cell culture system in combination with iodixanol purification9,10,11,12. For AAV.PHP.eB this entails a labor-intensive process to culture and transfect cells to obtain sufficient vectors for one experiment8. Therefore, the production of AAV in suspension cell culture in conical tubes was developed. Conical tubes, with a capacity of up to 300 mL, are compact, saving both incubator space and plastics. Suspension cells are much easier to culture and handle in large amounts than adherent cells on 15 cm plates. The transfection components of the protocol remain the same. Therefore, plasmids previously used with the adherent system can easily be used in this protocol based on production in suspension cells. The protocol was successfully transferred to other researchers in the laboratory and successfully used for various capsids and constructs.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير العلاج الجيني بنواقل AAV عالية الغلة من خلال زراعة الخلايا المعلقة HEK293

إنتاج دفعات ناقلات مرتبطة ب Adeno عالية الإنتاجية باستخدام خلايا تعليق HEK293

Our lab uses viral vectors as a platform to deliver therapeutic genes to the injured nervous system. Recently, numerous non-invasive viral vectors which are able to cross the blood-brain barrier have been developed. Use of these vectors requires high titers and therefore an improved production process.The implementation of our HEK293 Suspension Cell Procedure makes this AAV protocol less laborious compared to other adherent cell based systems, while at the same time gaining higher yields of AV vectors. There are no treatments to repair the damage in the central nervous system. We aim to use non-invasive viral vectors to stimulate central nervous system repair.The advantage of this protocol is that we can now produce viral vectors at high yield, which allows us to perform non-invasive therapeutic gene delivery to the injured central nervous system. Our current work will pave the way to develop non-invasive gene therapy for multiple neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis, Parkinson's and Alzheimer's disease.

تستخدم معظم المختبرات الأكاديمية خلايا HEK293T الملتصقة لإنتاج AAV 8,9. في حين أن هذا يعمل بشكل جيد نسبيا عندما تكون هناك حاجة إلى كميات صغيرة من AAV للحقن المباشر ، هناك حاجة إلى عيار أعلى 100 مرة (الحد الأدنى 1 ×10 11 GC / الماوس) لتحقيق نقل مماثل مع قفيصات جهازية م?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy with High-Yield AAV Vectors Through HEK293 Suspension Cell Cultivation at JoVE.com

هنا ، يتم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على الخلايا HEK293 ، مما يؤدي إلى تقليل الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل باستخدام المكونات المتاحة لأغراض البحث من البائعين التجاريين.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

يستخدم مختبرنا النواقل الفيروسية كمنصة لتوصيل الجينات العلاجية إلى الجهاز العصبي المصاب. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من النواقل الفيروسية غير الغازية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي. يتطلب استخدام هذه النواقل عيارا عاليا وبالتالي عملية إنتاج محسنة.إن تنفيذ إجراء الخلية المعلقة HEK293 يجعل بروتوكول AAV هذا أقل صعوبة مقارنة بالأنظمة الأخرى القائمة على الخلايا الملتصقة ، بينما يكتسب في نفس الوقت عوائد أعلى من ناقلات AV. لا توجد علاجات لإصلاح الضرر في الجهاز العصبي المركزي. نهدف إلى استخدام النواقل الفيروسية غير الغازية لتحفيز إصلاح الجهاز العصبي المركزي.ميزة هذا البروتوكول هي أنه يمكننا الآن إنتاج ناقلات فيروسية بإنتاجية عالية ، مما يسمح لنا بإجراء توصيل جيني علاجي غير جراحي إلى الجهاز العصبي المركزي المصاب. سيمهد عملنا الحالي الطريق لتطوير علاج جيني غير جراحي للعديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل التصلب المتعدد ومرض باركنسون ومرض الزهايمر.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

1.5K Views.  Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW). يستخدم مختبرنا النواقل الفيروسية كمنصة لتوصيل الجينات العلاجية إلى الجهاز العصبي المصاب. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من النواقل الفيروسية غير الغازية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي. يتطلب استخدام هذه النواقل عيارا عاليا وبالتالي عملية إنتاج محسنة.إن ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير العلاج الجيني بنواقل AAV عالية الغلة من خلال زراعة الخلايا المعلقة HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.